Therapeutic screening and molecular basis for Congenital Nephrotic Syndrome of the Finish type (CNF)
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23K06165
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47040:Pharmacology-related
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
スイコ メリー・アン・ソテン 熊本大学, 大学院生命科学研究部附属グローバル天然物科学研究センター, 助教 (20363525)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | ネフローゼ症候群 / 腎糸球体 / Nephrin / 化合物スクリーニング / HiBiT-Nephrin / 糸球体上皮細胞 (ポドサイト) / フィンランド型先天性ネフローゼ症候群 (CNF) / ハイスループットスクリーニング / HiBiT NanoLuc system |
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| Outline of Research at the Start |
糸球体上皮細胞 (ポドサイト) は、糸球体基底膜を覆うように存在する足細胞として知られ、隣接する細胞同士の足突起の規則的な噛み合わせとその間のスリット膜により、糸球体ろ過の最終障壁として機能する。本研究では、スリット膜を構成する Nephrin (NPHS1) の遺伝子変異を原因とする難治性疾患、フィンランド型先天性ネフローゼ症候群 (CNF) に着目し、Nephrinの細胞膜局在の検出を可能とするHiBiT-Nephrin NanoLuc恒常発現システムの構築とその検証、さらに、変異体Nephrinの膜上発現を制御する化合物や分子の探索のためのスクリーニングの実践を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
フィンランド型先天性ネフローゼ症候群 (CNF) は，腎糸球体の最終濾過膜 (スリット膜) を形成するタンパク質Nephrinの遺伝子 (NPHS1) 変異で引き起こされ，生後3ヵ月以内に高度タンパク尿を呈する希少難治性腎疾患である．Nephrin変異体の細胞膜上発現の低下により病態が発症することから，本研究では，HTSに耐えうるNephrinの膜上発現評価系の構築および化合物スクリーニングを企図した．まず，Nephrinの細胞外ドメインにHiBiTを付加したHiBiT-NephrinをHEK293T細胞に過剰発現させ，その膜上発現を特異的に発光で検出する評価系を確立した．このとき，臨床報告のある15種類の変異体のHiBiT-Nephrinの発光値は，既報のNephrin膜上発現の結果と正に相関した．次に，iPS細胞株を独自に樹立済みのE725D変異体に着目し，HiBiT-Nephrin安定発現細胞株を作製し，Selleck社の天然物化合物ライブラリー (計2601化合物) でのスクリーニングを行った．その結果，溶媒処置群 (対照群) の120 %以上の発光値を示す41個の化合物を同定した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定通り，CNFの新規治療薬の開発を究極の目的に，HiBiT-Nephirin評価系を用いた化合物スクリーニングを実施し，Nephrinの膜上発現を促進する化合物の探索を行った．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後，同様の化合物処置を行い，Western Blottingを行い，化合物処置により変動するHiBiTの発光値とp-NephrinおよびUpper band-Nephrin（N型糖鎖修飾（成熟度の指標））の発現量に相関があるか否かを検証する．さらに、Hit 化合物から2種類ずつを組み合わせ， HiBiT-E725D Nephrin安定発現細胞株に処置し，発光値を相加的に上昇させる化合物の組み合わせを探索する．将来的には，変異型 Nephrin 安定発現細胞株を用いたsiRNAスクリーニング（特に、小胞体品質管理機構に関わる分子のsiRNA）を行う．最終的に，CNFの新規治療薬開発における重要な基礎的知見を提供するとともに，Nephrinの膜上発現促進機構の解明に向けた研究を実施していく．
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Report
(1 results)
Research Products
(13 results)
