Natural product-based drug discovery for skin barrier dysfunction in atopic dermatitis

Research Project

Project/Area Number	23K06206
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 47050:Environmental and natural pharmaceutical resources-related
Research Institution	Nagasaki International University
Principal Investigator	宇都拓洋長崎国際大学, 薬学部, 教授 (90469396)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2027-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2026: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	アトピー性皮膚炎 / 皮膚バリア / 天然物 / 生薬 / フィラグリン / ケラチノサイト / 炎症性サイトカイン / オートファジー
Outline of Research at the Start	近年、アトピー性皮膚炎（AD）において皮膚バリア機能の低下が重要な要因であることが注目され、皮膚バリア機能の調節機構解明と改善に関する研究が活発に行われている。しかしながら、皮膚バリア機能を改善する天然物の多視点での探索や標的分子解明に関する研究は皆無である。本研究は、生薬エキスライブラリーのスクリーニングにより、フィラグリン増加、オートファジー制御、炎症性サイトカイン抑制を指標として皮膚バリア機能を改善する天然物の探索を行い、ヒト表皮三次元モデルを用いた効果の立証、さらに活性成分の作用機序解明や標的分子の同定を行うことで、ADの治療薬創出および治療標的分子発見に貢献することを目指す。
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、炎症性サイトカイン抑制、フィラグリン増加、オートファジー促進を指標として皮膚バリア機能を改善する天然物の探索を行い、ヒト表皮三次元モデルを用いた確実な効果の立証、さらに活性成分の作用機序解明や標的分子の同定を行うことで、アトピー性皮膚炎の治療薬創出および治療標的分子発見に貢献することを目指すものである。初年度は、130種の生薬エキスライブラリーから、炎症性サイトカイン抑制、フィラグリン増加、オートファジー促進活性を示すエキスの選抜を実施した。活性確認は、ヒト表皮角化細胞株HaCaTを用いた。炎症性サイトカイン抑制活性があるエキスは、TNF-α/IFN-γ処理により誘導されたIL-6およびIL-8を抑制するエキスをELISA法で探索した。その結果、細胞毒性を示さずIL-6およびIL-8両方を強く抑制する9つのエキスを見出した。同様にTNF-α/IFN-γ処理により抑制されたフィラグリン発現を回復させるエキスを、抗フィラグリン抗体を用いたWestern blottingで探索した。しかしながら、フィラグリンの増減の確認が難しかったため、現在インボルクリンやロリクリンなどの発現も同時に評価するスクリーニングを進めている。オートファジーを制御するエキスの選抜は、LC3-IIとp62の変動を指標としたスクリーニングを実施し、4つのエキスがLC3-IIおよびp62の発現を大きく変動させることを明らかにした。 IL-6およびIL-8を抑制するエキスのうち、特に活性が高かった4エキスを選抜し分離精製を進めている。そのうち1エキスにおいて、すでに活性画分を特定しており、活性成分の単離同定を進めている。オートファジーを制御するエキスは、マオウを先行して分離精製を進め、エフェドリン類が多く含まれるn-ブタノール画分に活性を見出した。現在、同画分のさらなる解析を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 130種の生薬エキスライブラリーから、炎症性サイトカイン抑制およびオートファジー促進活性を示すエキスの選抜は終了している。現在、特に活性の高いエキスを用いて、活性成分の単離同定を進めている。フィラグリン増加を示すエキスの選抜は、フィラグリンの増減の確認が難しかったため、インボルクリンやロリクリンの発現も同時に評価するスクリーニングを進めている。
Strategy for Future Research Activity	選抜したエキスから活性成分の単離同定を進める。より生体に近い評価を行うために、ヒト表皮三次元モデルをサイトカイン混合物（IL-4、IL-13、IL-31）で処理することでアトピー性皮膚炎様モデルを作製し、スクリーニングで選抜したエキスおよび活性成分の皮膚バリア機能改善効果を確認する。さらに、細胞およびヒト表皮三次元モデルで活性が立証された活性成分の作用機序を解析する。フィラグリン増加を示す活性成分は、フィラグリン前駆体であるプロフィラグリンのタンパク質・RNA発現を確認し、シグナル伝達系を解析する。オートファジー促進活性を示す成分は、阻害剤を用いたフラックスアッセイの結果からオートファジーのどのステップを制御するのかを確認する。炎症性サイトカイン抑制を示す活性成分は、サイトカイン類のRNA発現、さらにMAPKやNF-κBなどのシグナル伝達系を解析する。