| Project/Area Number |
23K06323
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48010:Anatomy-related
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
小池 正人 順天堂大学, 大学院医学研究科, 教授 (80347210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横田 睦美 順天堂大学, 大学院医学研究科, 助教 (10647415)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | iPS細胞 / 二次元培養 / オルガノイド / リソソーム / PRKN / ドパミン細胞 / ERMCS / 光顕・電顕相関観察 / 近接ライゲーションアッセイ / RNA-seq / ATP6AP2 / リソソーム不全 / 神経細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
リソソームの機能不全は希少疾患のリソソーム病のみならず、パーキンソン病などより頻度の高い神経変性疾患の発症にも関連することが知られている。しかし、神経細胞内におけるリソソーム機能不全のどのような応答がそれぞれの疾患の発症に関与するかについては不明な点が多い。そこで、順天堂大学ゲノム再生医療センターのリソースを最大限に活用し、健常者iPS細胞株より新たに細胞株を作出し、様々な領域の神経細胞への分化や脳オルガノイド作製を行う。得られた神経細胞や脳オルガノイドの形態学的、機能的解析および遺伝子発現解析を通して、リソソーム機能不全に対する神経細胞の応答性を明らかにすることを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
iPS由来神経細胞の分散培養系においては、長期の培養が困難である。しかし、通常用いる28日間の二次元培養方法の時点では、軸索と樹状細胞のマーカーであるTauとMAP2による免疫染色の結果、両者が全ての特記で共局在しており、その極性化が未熟であることが示唆された。そこで、神経細胞のより成熟した段階での各種解析を行うことを目的として、オルガノイドの作成を試みた。具体的には、所属研究室で作出済みのドパミン神経細胞特異的にGFPを発現するTyrosine Hydroxylase (TH)-GFP iPS細胞を用いて中脳オルガノイドを作出し49日間の分化誘導を行った。軸索と樹状細胞のマーカーであるTauとMAP2による免疫染色の結果、脳オルガノイドの辺縁の領域においてはTau陽性かつMAP、2陰性の突起が大部分を占めており、辺縁部を選択的に解析することによって軸索を区別できることを見出した。この系を用いて、中脳オルガノイドの辺縁部位において、ライブイメージングによるミトコンドリアの膜電位解析と電顕光顕相関観察 (Correlative light-electron microscopy; CLEM)を行った。その結果、健常者由来のドパミン神経細胞の軸索においては、非ドパミン神経細胞と比較してミトコンドリアの膜電位が低く長径が短いことが明らかとなった。
さらに、神経細胞からのより特異的なリソソームの解析を目指して、リソソームに局在する巻くタンパク質にHAタグをつけたTMEM192-3xHAをレンチウイルスの系でiPS細胞へ発現させるべくコンストラクトを導入し、目的の細胞のセレクションを行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
オルガノイドの系を立ち上げ、二次元培養法よりも分化した（軸索と樹状突起の極性が明確に区別できる）神経細胞での評価系が可能となった。さらに、最近の論文で報告された、免疫沈降法を利用した神経細胞からのリソソームの特異的な採取法を導入すべく、系の立ち上げに着手している。
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| Strategy for Future Research Activity |
TMEM192-3xHAを発現するiPS由来神経細胞より、抗HA抗体を用いた免疫沈降法を利用してリソソームを効率的に得る系を確立し、それをオルガノイドでも同様に行う。野生型のiPSのみならず、リソソーム機能不全を呈するのiPS細胞を作出し、同様にリソソームを得て、その性状を野生型のそれと比較する。
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