| Project/Area Number |
23K06329
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48010:Anatomy-related
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
太田 啓介 久留米大学, 医学部, 教授 (00258401)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伴 匡人 久留米大学, 分子生命科学研究所, 准教授 (00579667)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
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| Keywords | MAM / ミトコンドリア / オルガネラ間接触 / CLEM / コンタクトサイト |
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| Outline of Research at the Start |
細胞内ではミトコンドリアと小胞体が頻繁に接触している。近年この接触場に様々な分子が集まり、代謝障害など病気にも関係することが指摘されている。現在この接触場を光学顕微鏡で可視化する方法がいくつも開発され、これにより細胞機能との関連が評価されている。しかし、光学顕微鏡で捉えた機能的な接触場が、はたして電子顕微鏡レベルでどのような姿なのかは十分評価されていない。我々はこれまでに、光学顕微鏡で観察した場所そのものを同じ試料上で電子顕微鏡観察し、三次元的に比較検討できる3D-CLEMという新しい技術を開発してきた。本研究は、この技術を使い光学顕微鏡的に検出される接触場の本当の姿を明らかにするものである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリア小胞体接触場Mitochondria associated membrane; MAMは単に小胞体とミトコンドリアが接触するだけでなく、ミトコンドリア外膜表面に様々なシグナル分子が集まる特別な膜ドメインとして生物学的にも疾患との関連性からも注目されている。そのためMAM観察用に光学顕微鏡レベルの様々なレポーターが開発され細胞機能との関連を評価に利用されているが、これらのレポーターで検出されるMAMが電子顕微鏡レベルでどのような構造と一致するのか十分評価されていない。本課題は３次元光顕-電顕相関顕微鏡（3D-CLEM）技術を用いて、光学顕微鏡レベルで評価されているMAMが電子顕微鏡レベルでどのような構造に相当するのかを同一試料上で相関観察し、各レポーターで検出されるMAMの構造的特徴を明らかにしMAMの多様性と機能との相関を試みるものである。今年度は、MAMレポータの収集（split GFP、NanoBiTを用いたMAMマーカーおよび近接ライゲーションアッセイ）を行うとともに、MAM検出に特化した免疫組織化学的3D-CLEM法の開発および、培養細胞用Array tomography法の歩留まり向上（細胞のすべてを余す所なく連続切片として取得し、かつ正確なアライメントを行うマーカー作製技術を確立した）、Array tomography法を用いて電子顕微鏡レベルで検出される３次元的なMAM構造の自動検出を目指したAIモデル作製を中心に進め、様々な状況に対応した学習データを取得するとともに、汎用的MAM検出モデル作製の実証を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本課題の根幹となるArray tomographyを用いたCLEMについては、連続切片の作製技術の大幅な改善による歩留まり向上が達成できた。また、免疫組織化学的CLEMに必須なラベリングについても実証が進みつつあり、概ね順調である。AIについては、ステップワイズAI学習において、どのようなトレーニングデータが必要かについて基礎的な検証を重ね、条件が異なっても同じモデルを用いて比較検討ができる識別モデルを作る手順が確立した。この様に技術的な側面はすべてクリアしつつあるといえる。
一方プローブについては、新しく入手すべきプローブについても、プローブ開発者と直接コンタクトを取ることができ、分与いただく方向で調整ができた。
以上の根拠から概ね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
３D CLEMは、包埋前の光学顕微鏡観察と、FIB－SEMもしくはArray tomographyとの組み合わせによるCLEMを想定していたが、より詳細な位置情報が得られるin-Resin CLEM法の応用を検討している。そのための新しい色素を導入し、現在検証を進めている。
また、免疫組織科学的手法とのCLEMでは形態保存の問題があり、十分な形態保存が可能かどうかを検討している。特に、固定については、形態保存を優先した場合に検出が難しくなる可能性が高く、現在、新しい固定法および、比較的弱い固定でも良い形態保存が望める試料作製法を検討しており、比較的良好な結果を得ている。
本課題では、この方法をCLEMに応用することを検討しており、今年度後半は特に免疫組織科学的手法と組み合わせたCLEMによるMAMの同定をすすめていく。
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