| Project/Area Number |
23K06367
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48030:Pharmacology-related
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| Research Institution | Tokyo University of Science, Yamaguchi |
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Principal Investigator |
中川 直 山陽小野田市立山口東京理科大学, 薬学部, 講師 (30707013)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 自閉症 / バルプロ酸 / 神経細胞 / Setd5 / Kap1 / Krab / 遺伝子発現変化 / SETD5 |
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| Outline of Research at the Start |
自閉スペクトラム症（自閉症）は遺伝要因と環境要因の相互作用で発症すると言われている。特に環境要因の一つとして妊婦のバルプロ酸（抗てんかん薬）摂取が出生児の自閉症リスクを高めることが知られているが、発症メカニズムは解明されていない。申請者は予備的な研究において、バルプロ酸処理により自閉症関連遺伝子Setd5が減少することを見出した。申請者はSetd5遺伝子の発現減少はマウスレベルで自閉症を発症することを既に報告しているため、本研究では、バルプロ酸とSetd5の減少を繋ぐ分子メカニズムの解明し、「Setd5の発現減少がバルプロ酸摂取による自閉症発症の原因である」ことをマウスレベルで検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではバルプロ酸曝露による自閉症発症機構の解明を目的としている。バルプロ酸の薬理作用の一つとして遺伝子発現制御が報告されているため、神経細胞（マウスNeuro-2a細胞）へのバルプロ酸処理により発現が変動する自閉症関連遺伝子を網羅的に同定したところ、バルプロ酸により有意に発現減少する遺伝子として、申請者が解析してきたSetd5が同定された。SETD5遺伝子のヘテロ欠損が自閉症患者で同定されており、Setd5ヘテロ欠損マウスは自閉症様症状を発症することを申請者らが既に報告済みである。これらのことから、Setd5の発現減少がバルプロ酸による自閉症発症に寄与する可能性が示唆された。
Setd5の発現を抑制する転写関連因子を探索するため、マウスNeuro-2a細胞における既存のChIP-Seqデータを解析したところ、Setd5遺伝子のエンハンサー領域に結合する転写抑制因子としてKap1が同定された。Kap1遺伝子を破壊すると、バルプロ酸によるSetd5の発現減少がほとんど観察されないことから、Kap1はバルプロ酸とSetd5の発現減少を繋ぐ分子と考えられた。
バルプロ酸によりKap1の発現は変動しないことから、Kap1はバルプロ酸存在下、何らかのメカニズムでSetd5遺伝子に誘引されると考えられた。このようなKap1の誘引は、およそ400種類存在するKrabタンパク質によって担われていると考えられている。解析対象とするKrabタンパク質を絞り込むため、バルプロ酸により発現誘導されるKrabタンパク質の同定を網羅的遺伝子発現解析により行ったところ、バルプロ酸によってRNAが誘導される44個のKrabタンパク質候補を抽出できた。このうち14タンパク質をコードするmRNAについて、RT-qPCRにより発現誘導されることを確認した。これらの遺伝子を破壊するためのCas9ベクターを作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
バルプロ酸処理によりSetd5遺伝子の発現が減少すること、また、それを仲介するタンパク質としてKap1を同定できた。さらに、Kap1タンパク質をSetd5遺伝子領域に誘引する可能性のあるおよそ400種類のKrabタンパク質のうち、バルプロ酸によるSetd5発現減少に関わると考えられる候補を44個まで絞りこむことに成功した。また、このうち14個についてはバルプロ酸により有意に発現が誘導されることを確認した。加えて、これら14個の遺伝子を破壊するためのCas9ベクターの作製も行った。
当初の計画では、解析対象とするKrabタンパク質について、これらを個別にsiRNAによって発現抑制し、バルプロ酸によるSetd5の発現抑制が回復するか検討する予定であったが、研究の過程で、ネガティブコントロールとして用いるランダム配列のsiRNAによってSetd5の発現が変動してしまうこと、またこの変動は製品のロットによって大きな差があることがわかり、急遽Cas9による遺伝子破壊に変更する必要が生じたが、研究の進行には影響がなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
解析対象とするKrabタンパク質について、これらを個別にCas9によって発現抑制し、バルプロ酸によるSetd5の発現抑制が回復するか検討する。ネガティブコントロールとして用いる空ベクターでは、siRNAとは異なり、Setd5の発現に影響しないことを確認済みである。
網羅的遺伝子発現解析から、バルプロ酸によって発現誘導される44個のKrabタンパク質候補を同定したが、一年目の研究でmRNAの発現誘導が確認できたのは14個にとどまった。他の30個についてはRT-qPCRで用いるプライマーの設計がうまくいかず、解析が出来なかったため、今後はこれらに対するプライマーをさらに複数用意し、発現誘導を確認したい。発現誘導が確認でき次第、それらに対するCas9ベクターを作製し、同様の実験を行ることで、責任Krabタンパク質の同定につなげる。
責任Krabタンパク質が同定でき次第、それらのノックアウトマウスを入手し、マウスレベルで当該Krabがバルプロ酸によるSetd5の減少に必要であること、およびこれらのノックアウトマウスはバルプロ酸による自閉症様症状の誘導に抵抗性があることを明らかにする予定である。
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