| Project/Area Number |
23K06370
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48030:Pharmacology-related
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
齋藤 直人 同志社大学, 生命医科学部, 准教授 (90334226)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | cAMP / プレシナプス / 蛍光プローブ / 長期増強 |
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| Outline of Research at the Start |
筆者らが開発したcAMP緑色蛍光プローブgCarviを用いて、cAMPマイクロドメイン仮説を立証する。仮説が提唱されてから40年程が経つが、その実体は不透明なままである。本申請課題では、生理学的に解析の進んでいる海馬苔状線維を対象に選び、神経活動依存的に生じるシナプス伝達調節に関して、シナプス毎の特異性を発揮する上で重要な、プレシナプスドメイン形成を可視化する。さらに、プレシナプスドメイン形成メカニズムとして、Phosphodiesterase活性等が必要なことや、シナプス小胞群クラスター空間が、サブマイクロドメインとして機能していることを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請課題を推進するうえで、海馬苔状線維プレシナプスの長期増強を定量的に解析し、プレシナプスのcAMP動態を解析する必要がある。
海馬苔状線維プレシナプスで生じる長期増強を定量化する目的で、赤色蛍光型エキソサイトーシスプローブを作製した。具体的には、シナプス小胞膜タンパク質であるSynaptophysinの小胞内腔側の配列部位に、pH感受性赤色蛍光タンパク質pHmScarletを、HAタグ配列を介して挿入した。神経細胞特異的高発現ベクターである、pAAV-SynTetOffベクターに組み込み、培養海馬神経細胞に遺伝子導入したところ、フィールド電気刺激によってプレシナプスブートンのエクソサイトーシスを赤色蛍光で可視化することに成功した。
緑色蛍光cAMPプローブであるgCarviを、プレシナプスに局在化させる目的で、シナプス小胞結合タンパク質であるSynapsinと融合させるコンストラクト作りを進めた。すでに、Synapsin全長を融合させたgCarviが、プレシナプスに局在化することは報告しているが、このコンストラクトはAAVのパッケージングサイズを超えてしまうため、AAVベクターを利用できない。今回、Synapsinの部分配列としてCドメインを除いてもプレシナプスに局在化させることに成功した。このgCarvi-SynapsinΔCはAAVにパッケージングすることも可能であるものの、ほぼ限界の長さである。現在、このgCarvi-SynapsinΔCをもとに、どこまでSynapsin配列を短くできるか、検討中である。
上記2種類のコンストラクトを海馬苔状線維で使えるようにすることで、海馬苔状線維長期増強時のプレシナプスにおけるcAMP動態と、長期増強によるエクソサイトーシスの増加を単一プレシナプスで評価できるようになる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
pHmScarletを用いたシナプス小胞エクソサイトーシスの可視化が可能であることまでは確かめた。しかし、安定的な計測には至っておらず、発現プロモーターを検討する必要があると考えている。現状、神経細胞特異的高発現プロモータであるSynTetOffを用いているが、高発現なためバックグラウンドも高くなってしまっている。SynapsinプロモーターやCaMKⅡプロモーター配列に組み換えてテストする。
プレシナプスへの有効なターゲット配列はあまり報告されておらず、Synapsin配列が第一候補となる。しかし、ターゲットを目的とする配列としてはSynapsin配列は長すぎて不便である。初年度の結果として、すでに半分以下の配列長でプレシナプスにターゲットできることを見つけている。この結果は本研究以外でも、プレシナプスに目的分子をターゲットさせたいときに、有効なツールとなる。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に作製したエクソサイトーシスプローブ及びプレシナプスターゲット型cAMPプローブを、海馬苔状線維に適用できるように最適化していく。海馬苔状線維プレシナプスのcAMP動態に最適化した、gCarviを選択する必要がある。この目的のため、cAMP親和性の異なる各種のgCarviを作製する。また、研究対象の構造が小さいため、gCarviのダイナミックレンジの拡大も必要かもしれない。一方、AAVベクターを用いたin vivoインジジェクションや、海馬苔状線維が観察しやすい海馬スライスの作製に関して、条件検討を重ねる必要もある。
海馬苔状線維の長期増強は誘導刺激によって生じるcAMP上昇が必須と考えられているが、cAMP上昇を抑制した際には長期増強が生じないのかは不明である。この点を明らかにする目的で、光活性化型cAMP分解酵素の作製を進める。cAMP分解酵素として、cAMP特異的PhosphodiesteraseサブタイプPDE4を用いる予定である。青色光受容体としてAsLOV2を選択する。AsLOV2融合型PDE4のスクリーニングを推進することで、青色光照射によってcAMPを分解する分子を作製できるものと考えられる。
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