| Project/Area Number |
23K06376
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
棟居 聖一 金沢大学, 医学系, 助教 (10399040)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 靖彦 金沢大学, 医学系, 教授 (20313637)
原島 愛 金沢大学, 医学系, 助教 (50705522)
木村 久美 金沢大学, 医学系, 助教 (60409472)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | RAGE / がん悪性化 |
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| Outline of Research at the Start |
研究代表者らは、ヒト骨肉腫細胞にパターン認識受容体RAGEを強制発現すると培養下で、悪性度の高いがん幹細胞が示す細胞形態であるスフェロイドを形成すること、そのスフェロイド形成に必須なRAGEの最小領域は細胞内・外領域ではなく膜貫通ドメインであること、さらに、霊長類特異的細胞内タンパク質POTEE (Prostate, Ovary, Testes and Embryo ankyrin domain family member E)が、RAGE膜貫通ドメインと相互作用することを見出した。本研究では、スフェロイド形成におけるRAGE膜貫通ドメインとPOTEEとの関係を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ヒト骨肉腫細胞におけるRAGE膜貫通ドメイン（TM-RAGE）と霊長類特異的タンパク質POTEEの相互作用がスフェロイド形成に与える役割を解明することを目的としている。今年度は以下の成果を得た。1．TM-RAGE高発現細胞の確立：TM-RAGEを安定発現するヒト骨肉腫細胞株（HOS）を樹立し、ウエスタンブロットにより高発現クローンを選択。これにより、次年度のスフェロイド形成およびTM-RAGEとPOTEEの共局在解析が可能となった。また、この細胞はスフェロイド形成に重要な役割を果たすと考えられることから、今後の機能解析においても重要な基盤となりうる。2．POTEEドメイン別組換えタンパク質の作製：POTEEのアンキリンドメイン、コイルドコイルドメイン、およびアクチン様ドメインのcDNAをCos-7細胞に導入し、アンキリンドメインおよびコイルドコイルドメインを高発現する細胞を確立。アクチン様ドメインについては現在クローニング中だが、TM-RAGEタンパク質は既に十分量が得られており、今後、これらの組換えタンパク質を用いてPOTEEとTM-RAGEの結合領域を解析する予定である。3．POTEEノックダウン細胞の作製：TM-RAGEを過剰発現するHOS細胞に対し、siRNAを用いてPOTEEの発現を抑制した細胞株を作製した。これにより、POTEEがスフェロイド形成やTM-RAGEとの相互作用に与える影響を直接評価できる基盤が整った。
これらの成果により、POTEEとTM-RAGEの結合領域およびその機能的役割を明らかにする準備が整い、次年度は計画書に示したメカニズム解明に向けた研究を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初、申請研究1年目に完了予定だった細胞の作製が本年度にずれ込んだため、予定よりもやや遅れているが必要な細胞株の選択は概ね完了した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度で遅れていた細胞株の作製が概ね完了したことから、来年度は共焦点レーザー顕微鏡を用いたTM-RAGEとPOTEEの局在の検出を行い、可能ならば3次元画像解析ソフトを用いて立体画像に変換し、TM-RAGE、POTEEの局在を立体的に観察する。また、組換えTM-RAGEタンパク質とPOTEEのアンキリ
ンドメイン、コイルドコイルドメイン、およびアクチン様ドメインの結合について親和性クロマトグラフィーにより検討する。また、HOSにTM-RAGEを強制発現させた細胞のPOTEE発現を抑制した細胞 、およびPOTEE過剰発現細胞のスフェロイド形成について検討する。
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