膵癌の浸潤に関与する新規がん抑制遺伝子PLEKHA2の機能解明と治療応用

• Project/Area Number: 23K06443
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 49020:Human pathology-related
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 村上 和成 大分大学, 医学部, 教授 (00239485)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 泥谷 直樹 大分大学, 医学部, 准教授 (80305036) ; 兒玉 雅明 大分大学, 医学部, 教授 (20332893) ; 水上 一弘 大分大学, 医学部, 准教授 (60548139) ; 平下 有香 大分大学, 医学部, 病院特任助教 (70771955) ; 木下 慶亮 大分大学, 医学部, 医員 (50867570)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 膵癌 / がん抑制遺伝子 / PLEKHA2

Outline of Research at the Start

膵癌は最も予後不良な癌の一つで、その理由として
・早期に浸潤癌に進展するため、根治切除術の適応になる症例が少ないこと
・既存の抗癌剤が奏功する症例が少ないこと
が挙げられる。したがって、浸潤に関わる分子メカニズムを解明して、それを治療標的とする新規治療法を開発すれば、膵癌の治療成績の改善が期待できる。
我々は膵癌の浸潤過程で8番染色体短腕（8p）が高頻度に欠失することを見出しており、8pの欠失によって発現低下を示す「PLEKHA2」について、膵癌の進展過程におけるPLEKHA2の機能的意義を明らかにすることにより新規治療法に確立につなげる。

Outline of Annual Research Achievements

はじめに、PLEKHA2の発現低下は膵癌細胞にどのような悪性形質をもたらすのかについて検討した。これまで、PLEKHA2低発現膵癌細胞株PANC-1にレンチウイルスを用いて強制発現すると、増殖能が低下することを見出している。この知見を検証するため、ドキシサイクリン（Dox）添加によって誘導性にPLEKHA2を発現する膵癌細胞株PANC-1/PLEKHA2およびそのコントロール細胞株PANC-1/vecを樹立した。Dox添加によりPANC-1/PLEKHA2はPLEKHA2タンパクを発現することをWestern blot法で確認した。さらにPLEKHA2の誘導性発現4日後まで増殖能を観察すると、PANC-1/PLEKHA2はPANC-1/vecに比べて50％程度増殖が抑制されていた。
そこで、PLEKHA2の誘導性発現はどのようなシグナル経路を介して細胞増殖抑制に寄与するのかを調べるために、Dox添加前後のRNAをPANC-1/PLEKHA2とPANC-1/vecから回収した。PANC-1/PLEKHA2において、Dox添加後にPLEKHA2 mRNAが誘導されることは確認した。今後、マイクロアレイを用いた網羅的発現解析とパスウェイ解析を施行する。
次に、PLEKHA2の発現動態と臨床病理学的因子との関連性を検証するために、膵癌切除検体の免疫組織化学を施行した。非腫瘍部の正常膵管上皮および上皮内病変（腺腫および上皮内癌を含む）では細胞質に強いPLEKHA2の発現を認めた。一方、浸潤癌では約６割の症例でPLEKHA2の発現低下を認めた。これまでの検討した症例において、PLEKHA2の発現レベルと患者の性別、年齢、腫瘍の分化度との関連性は認めなかった

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度の目標の一つは、PLEKHA2の発現レベルを調整可能な細胞株を樹立して膵癌細胞におけるPLEKHA2の機能的意義を明らかにすることである。Dox添加によりPLEKHA2の発現が誘導される細胞株はすでに樹立した。加えて、発現レベルを抑制する細胞株も現在作製しているところである。次年度以降は、これらの細胞株を用いてこれまでの研究結果の検証とさらなる機能解析を進めていく。
もう一つの目標は、ヒト膵癌組織でのPLEKHA2タンパクの発現動態の検証とその臨床的意義の解明である。免疫組織化学のための抗体選定と条件設定を完了させたのち、免疫組織化学を施行して発現レベルを調べたところ、浸潤癌ではPLEKHA2発現が低下していることが確認できた

Strategy for Future Research Activity

今回樹立したDox誘導性PLEKHA2発現細胞株PANC-1/PLEKHA2とは逆に、PLEKHA2を高発現している膵癌細胞株PK-59を用いて、Dox誘導性にPLEKHA2に対するshRNAを発現する細胞株を樹立する。これらの細胞株を用いてin vitroおよびin vivoの実験を施行することで、PLEKHA2の詳細な機能解析が可能になる。これまでPLEKHA2の細胞増殖能への関与に着目してきたが、その他の悪性形質（生存能や運動能、浸潤能等）についても解析を進める。
上述の細胞株のトランスクリプトーム解析を施行し、得られた発現プロファイルデータをパスウェイ解析することにより、PLEKHA2が関わるシグナル経路を同定する。さらに、シグナル経路上でバイオマーカーあるいは治療標的となりうる分子を抽出する。
ヒト膵癌組織におけるPLEKHA2の免疫組織化学解析を継続して、発現動態と臨床病理学的因子との関連性を検討する。とくに、術後経過が把握できている症例を多数解析することで、予後との関連性を明らかにする

Research Products

• [Journal Article] Disease trends after Helicobacter pylori eradication based on Japanese nationwide claims and the health check-up database (2023)
  • Author(s): Mizukami Kazuhiro、Sugano Kentaro、Takeshima Tomomi、Murakami Kazunari
  • Journal Title: World Journal of Gastroenterology Volume: 29 Issue: 4 Pages: 692-705
  • DOI: 10.3748/wjg.v29.i4.692
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Efficient Establishment of Bile-Derived Organoids From Patients With Biliary Cancer. (2023)
  • Author(s): Kinoshita K, Tsukamoto Y, Hirashita Y, Fuchino T, Kurogi S, Uchida T, Nakada C, Matsumoto T, Okamoto K, Motomura M, Fukuchi S, Sagami R, Nagai T, Gotoh Y, Fukuda K, Ogawa R, Mizukami K, Okimoto T, Kodama M, Murakami K, Moriyama M, Hijiya N.
  • Journal Title: Lab Invest. Volume: 103 Issue: 6 Pages: 100105-100105
  • DOI: 10.1016/j.labinv.2023.100105
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Experience-Related Factors in the Success of Beginner Endoscopic Ultrasound-Guided Biliary Drainage: A Multicenter Study (2023)
  • Author(s): Sagami Ryota、Mizukami Kazuhiro、Okamoto Kazuhisa、Noguchi Chishio、Sato Takao、Nishikiori Hidefumi、Kawahara Yoshinari、Wada Masahiro、Otsuka Yuichiro、Fukuchi Satoshi、Takihara Hiroshi、Kuraoka Naosuke、Suzuki Keita、Murakami Kazunari
  • Journal Title: Journal of Clinical Medicine Volume: 12 Issue: 6 Pages: 2393-2393
  • DOI: 10.3390/jcm12062393
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Patient-Derived Ex Vivo Cultures and Endpoint Assays with Surrogate Biomarkers in Functional Testing for Prediction of Therapeutic Response (2023)
  • Author(s): Tsukamoto Yoshiyuki、Hirashita Yuka、Shibata Tomotaka、Fumoto Shoichi、Kurogi Shusaku、Nakada Chisato、Kinoshita Keisuke、Fuchino Takafumi、Murakami Kazunari、Inomata Masafumi、Moriyama Masatsugu、Hijiya Naoki
  • Journal Title: Cancers Volume: 15 Issue: 16 Pages: 4104-4104
  • DOI: 10.3390/cancers15164104
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Overexpression of VSNL1 Enhances Cell Proliferation in Colorectal Carcinogenesis (2023)
  • Author(s): Aiba Takayuki、Hijiya Naoki、Akagi Tomonori、Tsukamoto Yoshiyuki、Hirashita Yuka、Kinoshita Keisuke、Uchida Tomohisa、Nakada Chisato、Kurogi Shusaku、Ueda Yoshitake、Shiroshita Hidefumi、Shiraishi Norio、Murakami Kazunari、Inomata Masafumi、Moriyama Masatsugu
  • Journal Title: Pathobiology Volume: 91 Issue: 2 Pages: 121-131
  • DOI: 10.1159/000533877
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Involvement of clusterin expression in the refractory response of pancreatic cancer cells to a MEK inhibitor. (2023)
  • Author(s): Amada K, Hijiya N, Ikarimoto S, Yanagihara K, Hanada T, Hidano S, Kurogi S, Tsukamoto Y, Nakada C, Kinoshita K, Hirashita Y, Uchida T, Shin T, Yada K, Hirashita T, Kobayashi T, Murakami K, Inomata M, Shirao K, Aoki M, Takekawa M, Moriyama M.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 114 Issue: 5 Pages: 2189-2202
  • DOI: 10.1111/cas.15735
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Differences in clinical features and morphology between differentiated and undifferentiated gastric cancer after Helicobacter pylori eradication (2023)
  • Author(s): Kodama M, Mizukami K, Hirashita Y, Okimoto T, Wada Y, Fukuda M, Ozaka S, Kudo Y, Ito K, Ogawa R, Okamoto K, Fukuda K, Murakami K
  • Journal Title: PLos One Volume: 18 Issue: 3 Pages: 0282341-0282341
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0282341
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Endoscopic Ultrasound Can Differentiate High-Grade Pancreatic Intraepithelial Neoplasia, Small Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, and Benign Stenosis (2023)
  • Author(s): Sagami Ryota、Yamao Kentaro、Minami Ryuki、Nakahodo Jun、Akiyama Hidetoshi、Nishikiori Hidefumi、Mizukami Kazuhiro、Yamao Kenji、Bhatia Vikram、Amano Yuji、Murakami Kazunari
  • Journal Title: Gut and Liver Volume: 18 Issue: 2 Pages: 338-347
  • DOI: 10.5009/gnl220521
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 化学療法が著効した膵頭部癌に生じた稀有な合併症の２例 (2023)
  • Author(s): 木下慶亮、岡本和久、野口春菜、福地聡士、広島康久、水上一弘、村上和成
  • Organizer: 第54回日本膵臓学会大会
• [Presentation] アデゾリズマブ＋ベバシズマブ併用療法とレンバチニブの治療効果および有害事象の比較検討 (2023)
  • Author(s): 岩尾正雄、遠藤美月、荒川光江、齋藤衆子、村上和成
  • Organizer: JDDW 2023 第31回日本消化器関連学会週間