| Project/Area Number |
23K06563
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49060:Virology-related
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
西尾 真智子 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70156040)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂 直樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (80867474)
太田 圭介 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (90625071)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | ハザラウイルス / N蛋白質 / RNA-binding / リコンビナントウイルス / N蛋白 / L蛋白 |
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| Outline of Research at the Start |
分節型のマイナス鎖RNAウイルスであるハザラウイルスをモデルウイルスに使用して、病原性の高いクリミア・コンゴ出血熱ウイルスの増殖機構を解明する。ウイルスの転写・複製機構の詳細を解明するため、機能に重要であると思われるN蛋白とL蛋白上の領域（アミノ酸）を検討する。それらの結果をもとに、機能に重要であると予想されたアミノ酸に変異の入った様々な人工ウイルスを作製し、ウイルス増殖に与える影響を検討する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
クリミア・コンゴ出血熱ウイルス(CCHFV)は致死性の高い人獣共通感染症の１つであり、研究にはバイオセーフティーレベル(BSL)４の施設が必要であるため、研究が制限される。そこで、遺伝的に最も近縁でBSL2で扱えるハザラウイルス(HAZV)をモデルウイルスとして使用し、ウイルスの転写・複製に重要なアミノ酸の解析を行うこととした。
ウイルスゲノムを転写・複製するためにL蛋白とN蛋白がゲノムに結合する事が必須である。まず、N蛋白の立体構造を考えて、RNA-bindingに重要な蛋白上の領域の解析を行った。N蛋白は立体構造を考えるとHeadの領域とStalk領域に分けられる。CCHFVのN蛋白の立体構造とも比較し、RNAとの結合に重要であると思われるアミノ酸としてHeadの領域のRegion 1と名付けた領域に７個、立体構造的に反対側のReagion 2の領域に３個、Stalk領域に７個、計17個のアミノ酸を選んだ。それぞれのアミノ酸に変異を入れたN蛋白を発現させ、ミニゲノムの系により活性を検討した。17個のアミノ酸の中で、Headの領域の411番目のアミノ酸に変異を入れたN蛋白のみが活性がなくなった。そこで、立体構造的に、この411番目のアミノ酸の周りでpositive chageを持つアミノ酸を10個選び、再度検討した。その結果、合計４箇所のアミノ酸が活性に重要であり、RNA-binding能にも関与している事が明らかになった。この4個のアミノ酸はリシンかアルギニンであるが、これらのアミノ酸をアラニンやグルタミン酸に変えると活性がなくなるが、リシンをアルギニン、アルギニンをリシンに変更しても活性は維持できた。つまり、これらのアミノ酸の電荷が重要である事が明らかになった。現在、これらのアミノ酸変異を持つ組換えウイルスが作製できるのか検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
すでに作製したミニゲノムの系を用いて、アミノ酸変異を入れたN蛋白が転写・複製するため機能を維持しているのかを検討できた。また、以前、別のウイルスでRNAと蛋白の結合をモノクローナル抗体による免疫沈降とPCRの組み合わせで検討した事があるが、すでに作製したHAZVのN蛋白モノクローナル抗体を使用し、同様の方法で検討する事ができた。これらの組み合わせにより、RNA-bindingに重要なN蛋白上のアミノ酸の同定に成功した。現在、同定したアミノ酸に変異を入れたウイルスがレスキューできるのか検討中である。ここまでのデータをまとめて、論文を作成する予定であり、概ね順調であると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
N蛋白はL蛋白と結合するが、アミノ酸に変異を入れて、両蛋白の結合に重要なアミノ酸を同定していく予定である。また、N蛋白はエンドヌクレアーゼ活性を持つ事がわかっているので、活性に重要なアミノ酸を同定していく予定である。エンドヌクレアーゼ活性を検討するためには大腸菌により蛋白を発現させ、精製し使用する必要があり、その準備を進めている。
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