染色体の核内配置編集による染色体転座の発生機序の解明

Research Project

Project/Area Number	23K06619
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 50010:Tumor biology-related
Research Institution	Fujita Health University
Principal Investigator	河村理恵藤田医科大学, 医科学研究センター, 助教 (20735534)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	稲垣秀人藤田医科大学, 医科学研究センター, 講師 (70308849) 倉橋浩樹藤田医科大学, 医科学研究センター, 教授 (30243215)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	染色体配置 / ゲノム編集 / 染色体配置編集 / 核内配置編集 / 染色体再構成 / 核内トポロジー
Outline of Research at the Start	染色体転座は、不妊やがん・白血病などの様々な疾患に関与している。転座は異なる2本の染色体に切断が起こり、その断片が誤って他方に結合することで形成される。しかし、詳しい分子メカニズムはまだ不明で、特に細胞核内において、染色体がどのようなふるまいをして転座が形成されるのか、その動的ダイナミクスはよくわかっていない。そこで本研究では、染色体の核内配置を編集して染色体転座を誘発し、染色体配置と転座発生頻度を解析することで、転座の発生機序の解明を目指す。また、転座により核内トポロジーが変化することが予測されるので、異常な遺伝子発現がどのような表現型に結びつくのかも明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	本研究では染色体配置と転座形成の関連性を明らかにするために、ゲノム編集技術を用いて染色体の核内配置を人工的に操作・編集するモデルシステムを構築すること、さらに人工的に転座を発生させ、核内での距離と転座発生頻度を解析し、転座の発生機序が染色体の核内配置に直接影響を受けているのかを明らかにすることを目的としている。この染色体配置編集には、細胞内でゲノム中の任意の場所に可逆的かつ誘導性のクロマチンループ構造を人工的に形成できるツールを応用する。 2023年度は、CRISPR/Cas12aによる標的部位を切断する手法とCRISPR/dCas9を用いた染色体配置を人工的に近づける手法に用いるgRNAの設計や、両手法がそれぞれワークするかの実験条件を検討した。CRISPR/Cas12aによる切断系では、CRISPRデータベースを参考にヒトX染色体上の複数箇所にCas12a gRNAを設計した。それぞれのgRNAの切断効率をin vitro assayにて確認し、切断効率の良いものを選択した。CRISPR/dCas9による染色体配置を人工的に近づける系では、Streptococcus pyogenesに由来するdCas9（Sp-dCas9）とStaphylococcus aureusに由来するdCas9（Sa-dCas9）を用いており、それぞれに対応した配列のgRNAを検討した。染色体配置の編集効率を良くするために、X染色体に特異的なリピート配列を標的にすることとし、データベースと文献からX染色体に特異的なリピート配列を検索し、Xp21.2とXq23にgRNAを設計した。gRNAの編集効率を評価するために、Sp-Cas9とSa-Cas9によるin vitro assayを組み立て、標的部位に作用するかを確認した。次に、切断系と染色体配置を人工的に近づける系とを同時に行う手法へと進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason gRNAの設計、クローニング、in vitro assayによる編集効率の評価に時間を要した。様々なクローニング手法を試したため、時間がかかった。また、in vitro assayでは、CRISPR/Cas12aやCRISPR/Sp-Cas9は確立されているが、CRISPR/Sa-dCas9については、gRNAの作成からin vitro assayまでを自分で設計する必要があったため、特に時間を要した。
Strategy for Future Research Activity	2024年度は、2023年度に引き続き、染色体配置を人工的に操作・編集するモデルシステムの構築を進める。さらに、転座発生が染色体の核内配置に直接影響を受けているのかを明らかにするために、構築したモデルシステムを用いて、人工的に転座を発生させ、核内での距離と転座発生頻度を解析する。転座発生頻度は、細胞コロニーのカウント、転座特異的PCRやデジタルPCR、間期核FISHで解析し、近接誘導しないコントロール細胞と比較することにより、転座発生が近接度合いに直接影響を受けるか否かを検討する。これにより、転座の発生機序を染色体の核内配置の視点から明らかにする予定である。