| Project/Area Number |
23K06712
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
松下 一之 千葉大学, 医学部附属病院, 准教授 (90344994)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石毛 崇之 千葉大学, 医学部附属病院, 主任臨床検査技師 (30757315)
西村 基 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (80400969)
星野 忠次 千葉大学, 大学院薬学研究院, 准教授 (90257220)
北村 浩一 千葉大学, 医学部附属病院, 臨床検査技師 (90842881)
小林 崇平 国際医療福祉大学, 成田保健医療学部, 講師 (90846940)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | c-Myc非依存的 / FIR（PUF60） / rRNA / mRNA / RPB6 / mTORC1経路 / リボソーム / c-Myc / FIR/PUF60 / スプライシング変異 / ドミナントネガティブ / 核小体 / RNA polymerase II / ribosomal RNA / 転写 / 癌化機構 |
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| Outline of Research at the Start |
核小体内におけるRNA polymerase IIによるribosomal RNAの転写と癌化機構の解明を目的に以下の検討を行う。c-my遺伝子の転写抑制因子FIRおよび優性阻害作用を持つFIRΔexon2はリボソームRNA（rRNA）、スプライシング因子（hnRNPs）、mRNA結合タンパク質、TFIIHのsubunitなど免疫沈降で共沈する。本研究ではFIRおよびFIRΔexon2は「c-Myc非依存性に核小体内におけるRNAPI/IIを介したrRNAの転写やリボソームタンパク質の産生の逸脱が癌化や神経発達異常」に関与しているのではないかと考え、そのことを詳細に解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和６年度に実施した研究実勢は以下の通りである。癌ではFUBP1-interacting repressor（FIR）のドミナントネガティブであるFIRΔexon2が発現しc-myc遺伝子の転写が活性化している。FIRおよびFIRΔexon2タンパク質が相互作用するタンパク質候補には多くのリボソームRNA,スプライシング因子（hnRNPs）,mRNA結合タンパク質、TFIIHのサブユニットなどが同定された。このことから、FIRおよびFIRΔexon2は遺伝子の転写のみならず、選択的スプライシングやリボソーム形成などにも関与していることが示唆された。さらに、がんや神経難病などでは、rRNAとmRNAの両方の転写調節が変化している。令和６年度では、FIR（PUF60）のスプライシング異常がmTORC1経路に与える影響を調べた。mTORC1はタンパク質合成に関わるため、rRNAとmRNAの転写調節とmTORC1への影響を調べた。近年、従来より研究しているFIR(別名PUF60)のスプライシング異常が線虫においてmTORC1を抑制して寿命を延ばすことが報告されている（Huang, W. et al.Nat Aging 2, 796-808 (2022))。FIRはmTORC1経路は細胞における分化、老化、免疫、代謝に広く影響していることが他の研究グループからも示唆されている。rRNAとmRNAの転写調節を共役については、FIR（PUF60）がTFIIH/p62のPH domainと相互作用すること、RNAPIとRNAPIIにはRNA polymerase subunit6（RPB6）と呼ばれる共通のN-terminal tail(NTT)があること、TFIIH/p62がFIRあるいはRPB6と直接相互作用することを令和６年度に調べた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ほぼ予定通りの研究が行えたと考えている。本研究では、PUF60/FIR/FIRΔexon2を軸として、がん細胞と正常細胞におけるリボヌクレオタンパク（RNPs）やリボソーム構成タンパク質の相違をしらべ、選択的スプライシングや転写mRNAネットワークの違い（選択性）を網羅的に調べ、癌化と神経難病のpathogensisとスプライシング変異の視点から同定することを目的として検討を行った。近年FIR(PUF60)のスプライシング異常が線虫においてmTORC1を抑制して寿命を延ばすことが報告されている（Huang, W. et al.Nat Aging 2, 796-808 (2022))。mTORC1経路は細胞における分化、老化、免疫、免疫応答、代謝に広く影響していることから、FIR(PUF60)のスプライシング変化は、癌化や免疫異常症や老化のメカニズムの解明に資すると考えられる。本研究の仮説である、本検討では、FIRのドミナントネガティブであるスプライシング変異(FIRΔexon2) が、FIRとTFIIH/p62のPH domainとの相互作用を阻害することにより、RPB6とTFIIH/p62のPH domainの相互作用が誘導されてrRNAとmRNAの両方の転写を活性するのではないか、という仮説の証明を行った。FIR（PUF60）は、スプライシングや転写に関与するが、タンパク質合成では核小体におけるrDNAの転写制御と細胞質におけるmRNAの転写の両方に関与していると考えられた。
FIRおよびFIRΔexon2に結合する低分子化合物は癌に特異的なリボソームの合成を阻害する新規の抗がん剤候補の作用機序についても検討することができた（千葉大学から特許取得済で2025年4月現在維持されている）。発明の名称：癌の予防剤および／または治療剤。 登録番号：第6057408号）。
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| Strategy for Future Research Activity |
FIRΔexon2とTFIIH/p62のPH domainとの直接作用を証明するためのＸ線結晶構造解析を目指す。残りの研究期間においては、より具体的な実験的事実として、FIRとTFIIH/p62のPH domainの直接的な相互作用を、それぞれのタンパク質を発現ベクターで作製し、X線結晶構造解析で詳細な結合部位を調べることを目的としたい。これまでの本研究の検討により、FIRΔexon2とTFIIH/p62のPH domainの構造上の特徴、およびisothermal titration calorimetry(ITC)の検討から、FIRΔexon2とTFIIH/p62のPH domainの直接的な相互作用が示唆される。この仮説の直接的な説明のためには、FIRΔexon2とTFIIH/p62のPH domainの純粋タンパク質を精製して、相互のＸ線結晶解析による直接作用を確認する必要がある。
FIR(PUF60)のスプライシング異常が線虫においてmTORC1を抑制して寿命を延ばすことが報告されている（Huang, W. et al.Nat Aging 2, 796-808 (2022))ことから、mTORC1経路は細胞における分化、老化、免疫、代謝に広く影響していると考えられる。今後は、FIR(PUF60)をはじめとするスプライシング異常とmTORC1経路の抑制メカニズムや、rRNAとmRNAの転写調節が共役される機序を詳細に調べる。
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