| Project/Area Number |
23K06750
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
田代 晴子 帝京大学, 医学部, 教授 (50433884)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
白崎 良輔 帝京大学, 医学部, 講師 (40569133)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | CAR-T / AML / CLL-1 / CRISPR screen |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、 CRISPR screenによる網羅的解析を利用し、CLL-1.CAR-T細胞の抗腫瘍効果を増強する至適因子 の探索を目的とする。Target 細胞(AML細胞株)にCRISPR-Knock outとactivation screenを行う ことによって、よりCLL-1.CAR-T細胞がより有効な患者群の同定、治療効果を増強する薬剤の 選定につながる情報が得られる。またEffector細胞(CAR-T細胞)にも同様のScreenを行うことに よって、CLL-1.CARのみならずCLL-1以外を標的としたCARにおいても抗腫瘍効果の増強が期待できる因子の特定につながる可能性がある。
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者のこれまでの研究で、恒常的IL-７受容体の共発現は、CLL-1.CAR-T細胞のサイトカイン非存在化での持続性を高め、抗腫瘍効果の増強に寄与することが確認されているが、このブースター因子の選択は、文献的考察、理論的に検討した上で選択したもので、さまざまな因子から網羅的に検討し選択されたものではない。 本研究においては、CLL-1.CAR-T細胞の抗腫瘍効果を増強する至適因子をCRISPR screenをもちいた網羅的解析によって同定することである。
初年度には、HL60-spCAS9、THP1-spCAS9にBrunelo libraryを形質導入した。更に、HL60- dCAS9-VP64、THP1-dCAS9-VP64にCalabrese libraryを形質導入した。これら細胞のうち、40MLN細胞をFlow cytometry (FCM)にてsortした。我々は上位10%、下位10%をソートし、更に、それら細胞が十分に再増殖するのを待ち、更に40MLN細胞の上位10%、下位10%をソートする事を2回行い、CLL-1の発現上昇、低下細胞の純化に成功した。これらをNext-generation sequence (NGS)によってデータを解析の上、MAGeCK algorithmを用い解析を行ったところ、遺伝子ごとにBrunelo libraryでは4つのsgRNA、Calabrese libraryでは6つのsgRNAがあり、これらの相同が得られて初めて有意ととるが、残念ながらランダムなsgRNAしか同定不可能であった。これらランダムなsgRNAを5個ずつ使用しHL60のCLL-1発現を確かめたところ発現の上昇、下降ともに認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
申請者は上記実験を行い、結果を得たものの、残念ながら期待通りの発現上昇、下降をもたらすsgRNAを得られなかった。原因としてHL60の中にも最初からCLL-1の発現上昇細胞、発現低下細胞などがあり、これらを純化してしまった可能性が高いと考えられる。このため、実験のやり直しが必要であったため遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回の失敗は発現上昇、下降の細胞を純化しすぎてしまった事が原因と考えており、当初の予定通りCLL-1発現上位10%と下位10%の一回のsortingでsgRNAを抽出する事とした。細胞は既に出来ており、現在この実験を計画している。
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