| Project/Area Number |
23K06760
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
大西 威一郎 東京医科歯科大学, 東京医科歯科大学病院, 助教 (70750214)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 合成致死 / 乳癌細胞株 / CRISPR library / in silico screening / 乳癌 / CRISPR screeningデータベース |
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| Outline of Research at the Start |
1)データベースを用いたBRCA1/2変異と合成致死因子の同定
2)候補遺伝子のvalidation
3)データベースおよび病理検体を用いた候補遺伝子の発現の確認
4)候補遺伝子の過剰発現、ノックアウトによる機能解析
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| Outline of Annual Research Achievements |
2023年度は、CRISPR library screening libraryより、BRCA1またはBRCA2変異陽性乳癌細胞株にessentialな候補遺伝子として11個(SF1, PHF5A, SF3B3, UBL5, COPB2, CDC27, EIF1AX, NPIPB6, CDK1, SS18L2,PCNA)同定した。そのValidationとして。各候補遺伝子のsiRNAを、正常乳腺細胞株:MCF10A、BRCA1変異陽性のHCC1395細胞、BRCA2変異陽性のHCC202細胞にそれぞれ導入して、候補遺伝子のknock downを誘導後に、MTS assayを行った。MCF10AおよびHCC 1395においては、各siRNAにおいて細胞増殖の抑制は認められなかったが、HCC202細胞では、11個のうち10個(SF1, PHF5A, SF3B3, UBL5, COPB2, CDC27, EIF1AX, NPIPB6, CDK1, SS18L2)において、細胞増殖の抑制が認められた。
候補遺伝子の検証として、データベース上では検討されていない細胞株での検討が必要と考え、BRCA1/2変異を有さない乳腺細胞株:MCF10A、および乳癌細胞株AU565細胞に、CRISPR-cas9システムにより。BRCA1またはBRCA2のノックアウト細胞の樹立を試みた。しかし、MCF10AおよびAU565細胞ともに、BRCA1またはBRCA2KO細胞において、細胞致死および細胞増殖の抑制が強いため、完全なノックアウト細胞株の樹立には至らなかった。
研究成果を、第112回病理学会総会において発表し、優秀演題症を獲得した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
候補遺伝子の検証用に用いる、乳腺細胞株:MCF10A、および乳癌細胞株AU565細胞へのに、BRCA1またはBRCA2のノックアウト細胞株の樹立に難渋しているため。細胞株のデータベースより、両細胞においては、BRCA1およびBRCA2はessenntialな遺伝子ではないことは確認していたが、実際にCRISPR-cas9を用いて、変異を導入すると、細胞致死および細胞増殖の強い抑制がかかり、限界期釈法またはsoft agar assayからの樹立が困難であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も、BRCA1またはBRCA2ノックアウトした、MCF10AおよびAU565細胞細胞株の樹立を継続するが、うまくいかない場合は。他の細胞株での代用、またはノックアウト細胞株の購入を検討する。
並行して、データベースおよび病理検体を用いた候補遺伝子の発現の確認や、各候補遺伝子の阻害剤の探索を行う予定である。
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