| Project/Area Number |
23K06828
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 51030:Pathophysiologic neuroscience-related
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
森野 豊之 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (10397953)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中森 正博 広島大学, 医系科学研究科(医), 助教 (30881297)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | パーキンソン病 / エンドソーム-ライソソーム系 / 品質管理 / α-シヌクレイン / オートファジー / 凝集体形成 / ライソソーム |
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| Outline of Research at the Start |
パーキンソン病は，α-シヌクレインの蓄積によって神経細胞の変性・脱落を生じ，多彩な臨床症状を呈する疾患である．病態機序としてエンドソーム-ライソソーム系の異常によるα-シヌクレインの分解障害が重視されている．われわれが同定した変異遺伝子は，タンパク質分解におけるチェックポイントとして非常に重要な機能を有しており，パーキンソン病との関連が強く示唆される．本研究の目的は，この遺伝子異常がパーキンソン病の発症に関与することを明らかにし，その分子機構，作用点を病因論的に解明することである．本研究成果により，パーキンソン病の病態を普遍的に抑制する新たな治療法開発，創薬への応用が期待される．
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| Outline of Annual Research Achievements |
パーキンソン病は，α-シヌクレインの蓄積によってドパミン神経を中心とした神経細胞の変性・脱落で多彩な症状を呈する疾患である．高齢化とともに患者数が爆発的に増加しており，病態機序に即した根本的治療法の開発が社会的急務である．病態機序としてエンドソーム-ライソソーム系の異常によるα-シヌクレインの分解障害が重視されている．われわれは，潜性(劣性)遺伝が推測されるパーキンソン病患者の遺伝学的解析からライソソームの機能維持に関わる新規の変異遺伝子を同定した．この遺伝子は，タンパク質分解におけるチェックポイントとして非常に重要な機能を有しており，パーキンソン病との関連が強く示唆される．本研究の目的は，この遺伝子異常がパーキンソン病の発症に関与することを明らかにし，その分子機構，作用点を細胞内小胞輸送，分解系の観点から病因論的に解明することである．本研究成果により，パーキンソン病の病態を普遍的に抑制する新たな治療法開発，創薬への応用が期待される．
本研究課題では，培養細胞を用いてパーキンソン病の重要な病態因子であるα-シヌクレインの分解や凝集体形成過程を解析する．まず，ゲノム編集によりα-シヌクレインの過剰発現と原因遺伝子のノックアウト細胞株を樹立した．原因遺伝子はライソソームの品質管理に関与しているため，ライソソームの膜損傷を引き起こすLLOMeやオートファジーを誘導するTorin 1を添加した後に，エンドソームやライソソーム，オートファジーのマーカーを免疫細胞化学的に染色し，形態学的・量的に評価した．その結果，ノックアウト細胞では通常状態からライソソームの膜損傷が認められ，損傷したライソソームのターンオーバーが低下していることが示された．また，ノックアウト細胞では，ウェスタンブロットによりリン酸化α-シヌクレインが増加していることも明らかになった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は，エンドソーム-ライソソーム系の機能解析とα-シヌクレイン凝集アッセイを行った．LLOMeを用いてライソソームの膜損傷を生じさせたところ，コントロール細胞では濃度および時間依存的にLLOMeによりライソソームの膜損傷が生じたが，ノックアウト細胞ではLLOMeを加える前からライソソームの膜損傷が生じており，傷害されたライソソームの再合成が大幅に遅延することが示された．また，オートファジーを誘導するとmTORやLC3などが増加するが，ノックアウト細胞ではオートライソソームの形成が低下し，リソファジーが抑制されていることが示された．α-シヌクレインの凝集アッセイでは，今のところ凝集体形成に差は認めていないが，予備実験でも確認したように，リン酸化α-シヌクレインがノックアウト細胞で増加していた．また，ノックアウト細胞を用いたレスキュー実験では，α-シヌクレインの凝集が抑制されるとともに，リン酸化α-シヌクレインの量も減少した．本年度計画していた解析は順調に進行しており，引き続き予定通り検討を進めていく予定である．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究方針としては，最終的に創薬への応用を見据えて，エンドソーム-ライソソーム系の機能解析およびα-シヌクレイン凝集アッセイにおける病態機序の解明を進めていく．これまでの解析で，ノックアウト細胞ではライソソームの品質管理が障害されることが明らかになった．ライソソームの品質管理については，近年研究が盛んに行われており，ESCRTなど軽微なライソソーム膜損傷を修復する機構だけでなく，膜性オルガネラの相互作用により能動的な脂質の輸送が重要な役割を果たしていることも明らかになってきた．ライソソームの品質管理において，これらの機構の複合的な働きが相互に補完し合いながら機能していることが推測されるため，当初予定していたよりも広範囲な分子間相互作用を検討する必要がある．それにより，細胞内における膜性オルガネラの相互作用の解明にもつながる知見が得られる可能性もある．今のところ，レスキュー実験においてα-シヌクレインの凝集が抑制されることが示されており，本研究の原因遺伝子の機能を亢進させるような薬剤がパーキンソン病に対する治療効果を有することも期待される．膜性オルガネラの品質管理を含めた病態機序の解明とともに，治療に対するアプローチも並行して進めていく．
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