| Project/Area Number |
23K07234
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
田嶼 朝子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (00328337)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
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| Keywords | 1型糖尿病 / 自己免疫性内分泌疾患 / ICA69 / 免疫寛容 |
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| Outline of Research at the Start |
1型糖尿病は自己免疫疾患の一つであり他の自己免疫性内分泌疾患を併発しやすいが、その病態はまだ不明である。一方、複数の自己免疫疾患を発症する自己免疫性多内分泌腺症候群（APS）1型の発症は胸腺における免疫破綻に起因することが明らかにされている。本研究では1型糖尿病の自己抗原の一つであるICA69が複数の臓器に発現していることと、胸腺においてICA69の発現を抑制するとそれらの組織に自己免疫反応が惹起されることに着目した。本研究の目的は、ICA69に対する自己免疫機構が破綻すると、1型糖尿病や併発する自己免疫性疾患あるいは一部のAPSの発症につながるという事象を解明することである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1型糖尿病は自己免疫疾患の一つであり、他の自己免疫性内分泌疾患を併発しやすい。その場合は1型糖尿病単独である時よりも血糖管理が困難になりやすく、患者の予後に影響する。1型糖尿病と他の自己免疫性内分泌疾患の合併においては免疫寛容の破綻が関連していると推測し、1型糖尿病の自己抗原の一つであるICA69が複数の臓器に発現していること、胸腺においてICA69の発現を抑制すると複数の組織に自己免疫反応が惹起されることに着目し、本研究を計画した。本研究ではICA69に対する自己免疫機構が破綻すると、1型糖尿病や併発する自己免疫性疾患の発症につながるという事象の解明を目的とする。
研究対象としてICA69をノックアウトした遺伝子組換えNODマウス（ICA-NODマウス）を用いた。繁殖は雄・雌共にICA-NODマウスのヘテロ欠損型を使用するが、ヘテロ欠損型の雌マウスは野生型と同様に糖尿病を発症しやすく、妊娠を契機に高血糖をきたすこともある。その場合は繁殖に使用できなくなるが、ヘテロ欠損型の雌マウスは雄マウスよりも出生数が少なく不足しやすいため、野生型の雌マウスを一時的に繁殖に使用する必要があった。
HE染色で各組織におけるリンパ球浸潤の程度を確認したところ、糖尿病発症前の段階で膵臓ランゲルハンス氏島にリンパ球の存在を認めたが、遺伝子型による差は明らかでなかった。末梢リンパ節における制御性T細胞の割合は、ヘテロ欠損型と比較してホモ欠損型でやや低下していたが、ヘテロ欠損型の中でも個体差があり野生型との差がみられないこともあった。検体数が少なく統計学的な評価はできなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
ICA-NODマウスはとくに野生型ならびにヘテロ欠損型の雌において糖尿病を発症しやすく、妊娠により高血糖が惹起されることもある。繁殖中のヘテロ欠損型の雌マウスが高血糖を呈した場合は使用することができなくなり、適切な雌マウスが不足することがあったため一時的に野生型の雌マウスを用いた。その間は実験に使用できるマウスが不足し、該当する週数で検体を採取できないことがあった。
免疫組織染色ならびにフローサイトメトリーにおいてはコントロールを用いた実験段階でそれぞれ試薬の濃度調整を要している。またフローサイトメトリーでは細胞を標識抗体で処理する途中過程で冷蔵保管することも可能であるが、その経過時間によって解析上細胞の分布が異なったため、実験条件を最適化することに時間を費やした。いずれにおいても採取できた検体数が少なかったため、実験が滞った。
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| Strategy for Future Research Activity |
HE染色、免疫組織染色については膵臓、甲状腺、唾液腺の検体数を増やす。HE染色では組織中のリンパ球浸潤の程度をスコア化し、定量的な評価を行う。免疫組織染色では各組織に対してCD45、CD4、CD8、インスリン、グルカゴン、ICA69の各抗体を用い、インスリンやICA69の発現ならびにCD4陽性細胞やCD8陽性細胞の存在を確認する。また脾臓ならびに腋窩・腹膜・膵臓から末梢リンパ節を採取し、分離した細胞をCD4、CD8、CD25、Foxp3で染色する。染色した細胞はフローサイトメトリーを用いて解析し、制御性T細胞（CD4+/CD25 +/Foxp3+）の割合を確認する。以上を野生型とヘテロ欠損型において比較し、ICA69発現の有無による差を検証する。
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