| Project/Area Number |
23K07391
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
長谷川 直之 筑波大学, 医学医療系, 講師 (00707820)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
有泉 俊一 東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (40277158)
土屋 輝一郎 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40376786)
岡田 浩介 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (80757526)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | NASH / Nrf2 / ferroptosis / 臓器連関 |
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| Outline of Research at the Start |
NASHは単純性脂肪肝から発症し，肝硬変，肝癌へ進行する．酸化ストレスは，NASHの肝炎症・線維化を進行させる重要因子であり，転写因子Nrf2は酸化ストレスの消去によってNASHを防御する．一方，ferroptosisは，鉄依存的に発生した過酸化脂質が蓄積し引き起こされる細胞死であるが，NASHにおける意義や役割は不明である．酸化ストレス防御とともに鉄代謝を主導するNrf2はferroptosisに関与すると予測されるが，その役割や機序は不明である．本研究課題は，NASHの病態と進展におけるferroptosisの役割と，ferroptosisにおけるNrf2の機能を明らかにする．
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| Outline of Annual Research Achievements |
転写因子Nrf2が，どのように鉄代謝に関与し，NASH進行とferroptosisに影響を与えるかを臓器連関の視点から明らかにするため，全身Nrf2遺伝子欠失マウス（Nrf2-KO）をベースに，腸管上皮細胞（鉄吸収），肝細胞（鉄の蓄積），Kupffer（鉄の貪食・処理）細胞を含むマクロファージにのみそれぞれNrf2を発現する組織細胞特異的Nrf2遺伝子レスキューマウスをCre-loxPシステムを用いて作製した．これらのマウスの各組織細胞におけるNrf2の発現は，Nrf2の直接支配を受けるNqo1のタンパク発現によって確認した．
これらのNrf2遺伝子レスキューマウスと野生型マウス（WT）に60%高脂肪食（オリエンタル酵母）+ fructose含有水（fructose 23.1g + glucose 18.9g/L）を24週間摂餌，自由飲水させた．WTは軽度の肝炎症を認めたのみであったが，Nrf2-KOでは中等度の肝炎症と線維化を伴うNASHが誘導されたが，このNASHは肝細胞特異的Nrf2遺伝子レスキューマウスでは軽減していた．腸管上皮細胞，マクロファージ特異的Nrf2レスキューマウスについては現在解析中である．
上記NASH誘導マウスでは，肝組織に鉄の沈着が認められたが個体差が大きく，鉄の代謝とferroptosisを十分に解析するのは困難と考え，先行論文を参考に2%の高鉄含有食を作製（オリエンタル酵母．高脂肪食ベースと通常食ベース）し，fructose含有水とともに摂餌させた．この結果，マウスの摂餌量が著しく減少し，2-3週間で80%以上のマウスが餓死するという事態となった．念のため，fructose含有水ではなく通常水で飼育・摂餌したが結果は同様であった．体重減少以外にはマウスの挙動に著しい異常はなかったため，鉄含有による強い匂いなどが摂餌に影響しているものと推測している．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
NASH誘導マウスでは，肝組織に鉄の沈着が認められたが個体差が大きく，鉄の代謝とferroptosisを十分に解析するのは困難と考え，先行論文を参考に2%の高鉄含有食を作製（オリエンタル酵母．高脂肪食ベースと通常食ベース）し，fructose含有水とともに摂餌させた．この結果，マウスの摂餌量が著しく減少し，2-3週間で80%以上のマウスが餓死するという事態となった．念のため，fructose含有水ではなく通常水で飼育・摂餌したが結果は同様であった．体重減少以外にはマウスの挙動に著しい異常はなかったため，鉄含有による強い匂いなどが摂餌に影響しているものと推測している．
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| Strategy for Future Research Activity |
腸管上皮細胞，マクロファージ特異的Nrf2レスキューマウスも含め，NASH病態については，血液生化学，immunoblot，qPCRを用いて解析を進める．また，高鉄含有食については，鉄含有量を0.5%に下げた食餌を作製中であり，今後各遺伝子改変マウスに摂餌させる計画である．
培養細胞を用いた研究については，培養マクロファージ細胞であるRAW264.3細胞について，CRISPR-CAS9によるNrf2のノックアウト細胞を作製することに成功した．今後この細胞を用いてferroptosis誘導剤erastin（DOJINDO）を負荷してferroptosisを誘導する計画である．
ヒト臨床標本を用いた解析では，大腸癌肝転移（50症例）の非癌部をコントロールとして，NASH50症例の非癌部に対しベルリンブルーによる鉄染色を施行した．現在，患者の臨床情報（血液生化学検査，病歴など）の情報収集ととりまとめを行っており，ベルリンブルーの染色強度とNrf2の免疫組織学的発現との関連を中心に比較解析を行っていく計画である．
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