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Usefulness of ORF dominance as a novel biomarker in cholangiopancreatic cancer

Research Project

Project/Area Number 23K07427
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 53010:Gastroenterology-related
Research InstitutionChiba Cancer Center (Research Institute)

Principal Investigator

喜多 絵美里  千葉県がんセンター(研究所), 消化器内科, 主任医長 (20773980)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 筆宝 義隆  千葉県がんセンター(研究所), 発がん制御研究部, 研究所長 (30359632)
末永 雄介  千葉県がんセンター(研究所), 発がん研究グループ 発がん制御研究部, 研究員 (80581793)
Project Period (FY) 2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
KeywordsORFドミナンス / 胆道癌 / 膵癌
Outline of Research at the Start

我々はこれまでの研究で、任意の転写産物がタンパクに翻訳されるか(coding RNA)、されないか(non-coding RNA)や、個々遺伝子の翻訳効率に関しては、Open Reading Frame dominance (ORF-D)という指標が、個々の遺伝子の翻訳効率と正に相関することを見出した。今回我々は、難治がんである胆膵癌におけるORF-Dのプロファイルを検討することで、予後予測に有用なバイオマーカーや治療標的の候補を見出すことを目的とし本研究を立案した。

Outline of Annual Research Achievements

遺伝子進化および生物進化の両過程においては、non-coding RNAに対するOpen Reading Frame dominance (ORF-D) のプロファイルが高い方へ移動しており、がんの進化においても類似性が見られることがわかってきた。ORF-Dはがんの進行過程を解明する上で有用な情報を与えてくれるが、ORF-Dを計算するためには、long-read RNA seq を含めたゲノム解析が必要であり、未解明の部分が多い胆膵がんを対象として、胆膵がんの患者由来オルガノイドを用いて検討を開始した。まずは患者由来腫瘍細胞から培養を開始し継代を行い、必要なDNA,RNAを抽出するとともに、マウスの皮下へ培養細胞を移植し、in vivoの検討を並行して開始している。臨床サンプルを用いた胆膵がん細胞の培養に際しては、膵液や胆汁による細胞へのダメージが強いため培養に不適切な検体も散見されることから、培養に用いる臨床検体の保存状態の見直しを行っている。一方で、初代培養工程が順調であれば、その後のDNA,RNAの抽出については問題なく進められており、一部は全ゲノムシークエンスを行い、ORF-Dを含めた解析に着手している。KRAS変異を有する膵臓オルガノイドを用いた検討では、培養細胞に比較しマウスの皮下腫瘍でORF-Dがnoncoding RNAおよびCoding RNA双方で有意に上昇していた。また胆管がんオルガノイドモデルとは異なり、ORF-Dの変動した遺伝子にはオートファジー関連遺伝子が有意に蓄積していた。現在、これまでの結果をpreprintとして公開し、論文の査読中である(Suenaga et al., BioRxiv 2023)。今後、患者由来オルガノイドのライブラリを増やし、癌種や進行度別のORF-Dプロファイルの解析や、正常細胞やマウス由来オルガノイドとの比較検討を行う予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

KrasLSL-G12D/+ Trp53flox/floxマウス由来の膵臓オルガノイドにin vitroでCre発現ベクター(Cre)又は空ベクター(V)を導入したオルガノイドをヌードマウス皮下に移植し、Creから発生した腫瘍(Sc)を得た。それぞれからRNAを抽出しlong-read RNA seqを行いORF-Dを計算したところ、Vに比較しCreで、Creに比較しScでORF-Dがnoncoding RNAおよびCoding RNA双方で有意に上昇した。また胆管がんオルガノイドモデルとは異なり、ORF-Dの変動した遺伝子にはオートファジー関連遺伝子が有意に蓄積していた。これら結果を含めこれまでの結果をpreprintとして公開し、現在、論文の査読中である(Suenaga et al., BioRxiv 2023)。また、これまで樹立し胆管がん患者由来オルガノイド2種類については全ゲノムシーケンス、long-read RNA-seqおよび一細胞long-read RNA-seqのRunを終了し、現在、データ解析中である。新たに家族性を疑う胆管がんオルガノイドおよび血液サンプルを得て、現在全ゲノムシーケンスを行っている。
胆膵がん患者由来オルガノイドの培養樹立のため、サンプルを収集しているが、臨床におけるサンプル取得の機会はばらつきがあり、なおかつ胆膵がん細胞の培養に際しては、膵液や胆汁による細胞へのダメージが強いため培養に不適切な検体も散見されることから、適切な検体での培養作業はやや遅れていると考えている 。培養工程が順調であれば、その後のDNA,RNAの抽出については問題なく進められており、培養に用いる臨床検体の保存状態の見直しを行っている。

Strategy for Future Research Activity

これまでに得た患者由来オルガノイドのオミックスデータの解析を進めるとともに、胆管がん発癌リスクとなる病態とORF-D変動の関係を調べるため患者由来オルガノイドのlong-read RNA seqを行う。また、家族性が疑われるサンプルのデータから胆管がん発癌リスクとなる変異やORF-D変動遺伝子を同定する。
膵癌については、これまでの検討でマウス膵癌オルガノイドモデルでオートファジー関連遺伝子のORF-D変動を認めており、これら遺伝子の発現量を調べるとともに、オートファジーの関連遺伝子であるLC3およびp62発現量をシンプルウエスタンにより定量する。さらに培養液にDALGreenを添加しオートリソソーム可視化して蛍光顕微鏡による定量を行い、ホログラフィック顕微鏡によるリアルタイム観察を行いリソソーム動態を確認する。電子顕微鏡レベルではオートファゴソームやオートリソソームの変化に関する検討を併せて行う。並行して、膵癌の患者由来オルガノイドの樹立も進めていく。
胆膵がん患者由来腫瘍細胞を多く集め、安定した培養系を確立し、その後の工程を滞りなく進めていくことを目標とし、臨床検体の取り扱い方法の見直しを行うとともに、解析作業についても並行して行っていく。今後は患者由来腫瘍細胞だけでなく、正常細胞やマウス由来細胞についても解析を行っていく予定である。

Report

(1 results)
  • 2023 Research-status Report
  • Research Products

    (8 results)

All 2023 2022

All Journal Article (2 results) (of which Open Access: 2 results,  Peer Reviewed: 1 results) Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 4 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Global changes in open reading frame dominance of RNAs during cancer initiation and progression2023

    • Author(s)
      Yusuke Suenaga, Hiroyuki Kogashi, Kazuma Nakatani, Jason Lin, Yoshinori Hasegawa, Kazuto Kugou, Yusuke Kawashima, Eisaku Furukawa, Kazuhiro Okumura, Emiri Kita, Yuichi Wakabayashi, Mamoru Kato, Masahito Kawazu, Yoshitaka Hippo
    • Journal Title

      bioRxiv

      Volume: 6.2 Pages: 543339-543339

    • DOI

      10.1101/2023.06.02.543339

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Open Access
  • [Journal Article] Derivation of pancreatic acinar cell carcinoma cell line HS‐1 as a patient‐derived tumor organoid2022

    • Author(s)
      Hoshi Daisuke、Kita Emiri、Maru Yoshiaki、Kogashi Hiroyuki、Nakamura Yuki、Tatsumi Yasutoshi、Shimozato Osamu、Nakamura Kazuyoshi、Sudo Kentaro、Tsujimoto Akiko、Yokoyama Ryo、Kato Atsushi、Ushiku Tetsuo、Fukayama Masashi、Itami Makiko、Yamaguchi Taketo、Hippo Yoshitaka
    • Journal Title

      Cancer Science

      Volume: 114 Issue: 3 Pages: 1165-1179

    • DOI

      10.1111/cas.15656

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] がん進化におけるORFドミナンスの変動2023

    • Author(s)
      末永雄介
    • Organizer
      第11回タタバイオ分子クラブ (ランチョンフォーラム)
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] がん進化におけるORFドミナンスのグローバルな変動2023

    • Author(s)
      末永雄介
    • Organizer
      第82回日本癌学会学術総会 インターナショナルセッション11
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] がん進化におけるORFドミナンスの変動と遺伝子誕生2023

    • Author(s)
      末永雄介
    • Organizer
      第208回NIH金曜会セミナー, NIH Building 37, ベセスダ、アメリカ
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 高齢者における経口膵管鏡 (POPS) の有用性に関する検討2023

    • Author(s)
      喜多絵美里
    • Organizer
      第54回日本膵臓学会大会 パネルディスカッション6
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] Diversity of EUS Tissue Acquisition~the genome and beyond~2023

    • Author(s)
      喜多絵美里
    • Organizer
      第106回日本内視鏡学会総会(Japan digestive disease week) サテライトセミナー
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Invited
  • [Book] 上皮性腫瘍 (2) 嚢胞性膵腫瘍 1) 膵管内乳頭粘液性腫瘍 (IPMN) (4) 症状・血液検査2023

    • Author(s)
      喜多絵美里
    • Total Pages
      525
    • Publisher
      日本臨床
    • Related Report
      2023 Research-status Report

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Published: 2023-04-13   Modified: 2024-12-25  

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