| Project/Area Number |
23K07431
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
高山 敬子 筑波大学, 附属病院, 病院講師 (40925103)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡田 浩介 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (80757526)
土屋 輝一郎 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40376786)
内田 文彦 筑波大学, 医学医療系, 講師 (70736008)
鈴木 英雄 筑波大学, プレシジョン・メディスン開発研究センター, 客員教授 (00400672)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | NASH / 歯周病 / Nrf2 / Porphyromonas gingivalis / 臓器連関 / 非アルコール性脂肪性肝炎（NASH） / Lipopolysaccharide（LPS） / 腸肝連関 |
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| Outline of Research at the Start |
申請者らが作製した“組織細胞特異的Nrf2遺伝子レスキューマウス”は，腸管上皮細胞，肝細胞，Kupffer細胞を含むマクロファージにのみそれぞれNrf2を発現する．この組織細胞特異的Nrf2遺伝子レスキューマウスを研究に用いることにより，組織細胞ごとのNrf2を介した腸肝連関におけるLPSの動態，シグナル伝達，更には，組織細胞間のNrf2の連携と，それらがNASH病態に与える影響を比較解析することが可能となった．本研究課題の目的は，これらの新規Nrf2遺伝子改変マウスを用いて，歯周病原菌LPSを介した腸肝連関の視点からNASH発症進展におけるNrf2の防御機構を解明することである．
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，臓器連関の視点からLPSを介したNASH腸肝連関におけるNrf2の役割を解明することを目的とし，全身Nrf2遺伝子欠失マウス（Nrf2-KO）をベースにKupffer細胞（肝臓マクロファージ），にのみNrf2を発現するマクロファージ特異的Nrf2遺伝子レスキューマウス（Nrf2-mRes）を作製した．これらのマウスと野生型マウス（WT）に，60%高脂肪食を5週齢から23週齢の18週間摂餌させ，並行して17週齢から23週齢の6週間にわたり，Porphyromonas gingivalis（P.g）由来のLPSを 0.3mg/kg投与し，NASHの病態を比較した．
高脂肪食摂餌により，3系統のマウスで肥満が認められたが，各群で大きな差は認められなかった．また，GTTやITTによる評価では，むしろWTよりもNrf2-KOで耐糖能は軽快していた．一方，WTでは肝の脂肪化は認めるものの肝炎症線維化は乏しかったが，Nrf2-KOではNASHを発症し，更に，Nrf2-mResでは，これらの肝炎症と線維化が軽減していた．Steatosis activity fibrosis score（SAF score）による肝の脂肪化・炎症・線維化の定量評価でも，同様の結果が有意差を持って認められ，qPCR解析でもNrf2-KOでは炎症・線維化に関わる因子のmRNA発現が増加していたものの，これらの変化がNrf2-mResでは経過していた．肝組織でのF4/80のimmunoblotはNrf2-KOとNrf2-mResでは同程度であったにも関わらず，LPS binding protein（LBP）の発現は，Nrf2-mResで軽減しており，マクロファージにおけるNrf2の発現が肝臓におけるLPSの代謝（解毒）に重要な枠割を果たしていることが示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では，歯周病菌LPSとNASHの腸管連関におけるNrf2の役割を明らかにする目的で，Porphyromonas gingivalis（P.g）由来のLPSの腹腔内投与＋高脂肪食摂餌モデルと，P.g生菌それ自体の経口ゾンデ投与+高脂肪食摂餌という2つのモデルを計画した．
そのうち，P.g由来LPS腹腔内投与モデルについては，先述したようにマクロファージのNrf2がLPSの解毒代謝に重要な役割を果たすという結果が得られた．ただし，LPS腹腔内投与モデルでは，P.gが腸管細菌叢に与える影響や，腸管上皮のNrf2の役割を検討できないため，今後は腸管上皮細胞特異的Nrf2レスキューマウスも含めて，P.g生菌をゾンデ投与し，NASHの表現型，更に，P.gによる小腸上皮や内臓脂肪への影響を解析する計画である．遺伝子改変マウスの繁殖は問題なく進捗しており，P.g生菌のゾンデ投与を開始している．
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| Strategy for Future Research Activity |
P.g生菌の経口ゾンデ投与が完了次第，肝組織の病理標本評価によるNASHの病勢評価，血液生化学検査，qPCRを行う．また，P.gが小腸上皮に与える影響については，HE染色による小腸上皮の障害の評価に加え，粘液分泌タンパクであるMuc2やtight junctionタンパクであるZo-1の免疫染色，また，F4/80免疫染色によりマクロファージの浸潤程度を評価する．また，P.gにより内臓脂肪への炎症波及も想定されるため，精巣上体の白色脂肪の炎症（crown like structureなど）を評価予定である．
臨床研究については，肝臓生活習慣外来に通院していたNAFLD患者について，歯周病の評価を行い，血液生化学検査，腹部超音波検査などのNAFLDに関わる臨床情報についてデータの集積・解析を開始している．
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