| Project/Area Number |
23K07438
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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| Research Institution | Kawasaki Medical School (2024)
Okayama University (2023) |
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Principal Investigator |
白羽 英則 川崎医科大学, 医学部, 教授 (40379748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩室 雅也 岡山大学, 大学病院, 助教 (30645403)
大西 秀樹 岡山大学, 大学病院, 講師 (30595468)
堀口 繁 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (70761104)
内田 大輔 岡山大学, 大学病院, 講師 (50749215)
竹内 康人 岡山大学, 大学病院, 講師 (70814200)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 遺伝子治療 / 肝がん / 膵がん / 癌幹細胞 / がん幹細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
消化器がん（肝がん, 膵がん）のがん幹細胞(CSC)に対する新規標的治療を開発する。CSC治療薬は、消化器がん遺伝子治療薬として開発中のAd-REICを用い、CSC評価には、バイオチップによる循環血中がん細胞検出系を応用して以下の検討を行う。
【解析１】ＣＳＣ評価系の確立
【解析２】抗がん剤投与後のＣＳＣ解析
【解析３】培養細胞におけるAd-REICのCSCに対する効果の検証
【解析４】マウスモデルでAd-REICのCSCに対する効果の検証
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん患者からの末梢血循環がん細胞およびがん幹細胞の検出を想定して、培養がん細胞を使用して疑似患者血液を作成してがん細胞及びがん幹細胞検出が可能かどうかの検証を行った。健常者血液に培養がん細胞（PLC, Hep3B, HepG2）を１０万個/ｍLで付加し、EasySepPBMC（Stemcell Technologies社）マグネットビーズ法でがん細胞を含む末梢血単核細胞（PBMC）分画を分離し、CRESTコートスライドグラス（松浪硝子工業）に展開した。抗pan-サイトケラチン抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、がん細胞を同定した。また、抗CD45抗体を用いて白血球を蛍光免疫染色してがん細胞以外の細胞を除外した。抗幹細胞抗体(EpCAM, CD133, CD90, CD44, CD24)でがん幹細胞を同定した。細胞数は、顕微鏡で3視野の陽性細胞数の平均で評価した。分離無しをコントロールとした。PLCではコントロールで7.7-11個のがん細胞を検出(回収率39-73％)。分離前後の幹細胞陽性率は、EpCAM 0%, CD133 34.8%→17.6%, CD90 24.0%→5.6%, CD44 4.2%→0%, CD24 66.7％→92.3％であった。Hep3Bでは、分離前のがん細胞でがん幹細胞の検出を試み、EpCAM 85.8%, CD133 84.4%, CD90 0%, CD44 0%, CD24 90.1％の幹細胞が検出された。HepG2では、EpCAM 33.0%, CD133 2.3%, CD90 0%, CD44 0%, CD24 13.0％の幹細胞が検出された。EasySep改良法とCRESTガラスを用いて血液中の39-73％のがん細胞を検出可能であった。また、複数抗体併用によりがん幹細胞も検出が可能であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度前半は、当該研究者が岡山大学から川崎医科大学に異動して、研究室を稼働させるための準備を行った。新たな研究室の立ち上げや細胞培養環境の整備に時間を要したものの、研究室が本格的に稼働し始めてからは、順調に研究を遂行することができた。
各種培養がん細胞を用いたて作成した疑似がん患者血液を用いた検討により、末梢血からのがん細の検出が可能であり、がん幹細胞についても複数の抗体を組み合わせることによりほぼ全癌種で検出可能であることが明らかとなった。細胞の検出の自動化を目的として独自のpythonプログラムを開発し、蛍光顕微鏡画像からがん細胞を自動同定・計数することにも成功した。
前年度後半から、今年度前半にかけては、異動に伴う一時的な研究の停滞が見られたが、研究環境が整備されるにつれて徐々に研究活動の速度が回復し、遅れを取り戻せるようになってきている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、岡山大学病院および川崎医科大学総合医療センターにおいて肝がんおよび膵がん患者の血液解析ができるように新たに研究計画の倫理委員会申請を行う。その後抗がん剤治療前後で末梢血の採取を行い血液循環がん細胞（CTC）及び血液循環がん幹細胞（CSC）の評価を行っていく。患者血液及び、培養がん細胞［肝がん細胞(Hep3B, PLC, Huh7, HLE, SK-Hep1)及び膵がん細胞（AsPC-1, Panc-1, MIAPaCa2, SUIT-2）］を用いた疑似血液を用い、幹細胞の検出には、EpCAM, CD133, CD90, CD44, CD24それぞれの抗体で検出するとともに、これらの抗体を混合した抗体カクテルも用いて検出効率の向上についても検討していく。遺伝子治療薬Ad-REICの肝がんに対する治験が前年度に中止されたことを踏まえ、代替えの幹細胞治療薬としてγセクレターゼ阻害剤を用い、がん幹細胞に対する効果を検証する。更に、可能であればマウスモデルを作成してAd-REICのがん幹細胞に対する効果についても検証する予定である。
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