| Project/Area Number |
23K07439
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
松本 俊彦 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (70634723)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤澤 浩一 産業医科大学, 産業生態科学研究所, 教授 (00448284)
高見 太郎 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60511251)
山本 直樹 山口大学, 教育・学生支援機構, 教授 (90448283)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 間葉系幹細胞 / 肝線維化 / microRNA / 細胞外小胞 |
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| Outline of Research at the Start |
我々は肝移植に代わる肝硬変治療法として「自己骨髄間葉系幹細胞(MSC)を用いた肝臓再生療法」を開発してきた。医師主導治験で有効性が示唆されたが、継続性が今後の課題である。本研究では、治験での有効症例のMSCと血清を用いて体内でのMSCの表現型を再現し、MSC由来細胞外小胞(EV)の治療効果を担うmicroRNAを同定する。Drug delivery systemには、EVより小型で生物学的活性が高く、内包成分の調整により有効性を高めた脂質ナノ粒子を作製する。以上により頻回投与可能な抗線維化薬「MSCの作用を洗練・集約化した抗線維化microRNA封入脂質ナノ粒子」を開発し、Proof of conceptを取得する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は肝移植に代わる肝硬変治療法として「自己骨髄間葉系幹細胞 (MSC)を用いた肝臓再生療法」を開発してきた。医師主導治験で有効性が示唆されたが、継続性が今後の課題である。本研究では治験での有効症例のMSCと血清を用いて、肝硬変患者に投与された体内のMSCを再現し、MSC由来細胞外小胞 (EV)の治療効果を担うmicroRNA (miRNA)を同定する。Drug delivery system (DDS)には、EVより小型で生物学的活性が高く、内包成分の調整により有効性を高めた脂質ナノ粒子を作製する。以上により頻回投与可能な抗線維化薬「MSCの作用を洗練・集約化した抗線維化miRNA封入脂質ナノ粒子」を開発し、Proof of concept を取得する。
令和5年度は、治験症例MSC由来EV (MSC-EV)中のmiRNA profileとヒト肝星細胞内のmiRNA profileとの比較検討により抗線維化miRNAの同定を行った。具体的には、治験での有効症例3例のMSC培養時に生じた余剰MSCを用いて、培養上清中よりMSC-EVを回収した。MSC-EV中のmiRNA、ヒト肝星細胞3種 (HHSteC, LX-2, LI90)の細胞内のmiRNA を抽出し、miRNA array解析によりMSC-EV中で高発現、肝星細胞内で低発現のmiRNAを選出した (量的評価)。iPS細胞の山中因子が同定された際の手法を参考に、選出されたmiRNAを組み合わせで肝星細胞 (HHSteC)に導入し、線維産生 (collagen I, collagen III, Elastin)を抑制するmiRNAの絞り込みを行った (質的評価）。最終的に絞り込んだ複数のmiRNAをHHSteCに導入し、線維産生抑制効果を評価した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
医師主導治験「自己完結型肝硬変再生療法」において間葉系幹細胞肝動脈投与後1年の経過でChild-Pugh score 2点以上の改善を認めた有効症例のMSCについて、EV中のmiRNA profileの解析を行った。これをヒト肝星細胞内のmiRNA profileと比較し、MSC-EV中miRNAでシグナル強度1000以上、かつ肝星細胞内miRNAの100倍以上のシグナル強度を呈するもの 11種を選出した。さらに、11種全種または11種から1種を除いたmiRNAの組み合わせをHHSteCに導入して線維産生を比較し、線維産生抑制効果をもつmiRNA 5種を決定した。miRNA5種の線維産生抑制効果はmiRNA11種と同等であった。この成果は複数の国内学会および国際学会で報告した。また、これら5種のmiRNA cocktailについて特許出願(特願2023-189942)した。以上の進捗は当初の計画と概ね一致しており、順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度の研究成果を受けて、抗線維化miRNA 5種を導入したヒト肝星細胞における遺伝子発現変化を評価し、作用機序を明らかにする。続いて、これらの抗線維化miRNAを実験動物(マウス、ラット、イヌ等)の肝星細胞に導入して、種差を超えてヒト肝星細胞と同様の作用機序で線維産生抑制効果を示すかを確認し、in vivoでの評価に適する動物種を選択する。また、同様の手法を用いて、MSC-EV中で高発現、ヒトマクロファージ(Mφ)内で低発現のmiRNAを選出し、抗炎症かつ線維溶解の表現型を持つMφの誘導が可能かを検証する。
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