Investigation of biomarker in group 3 pulmonary hypertension

• Project/Area Number: 23K07597
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 花岡 正幸 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20334899)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北口 良晃 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 講師 (40447751) ; 和田 洋典 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 助教 (80848739)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: 第3群肺高血圧症 / 肺気腫 / バイオマーカー / 遺伝子ライブラリ / ラット

Outline of Research at the Start

慢性肺疾患に伴う肺高血圧症（第3群肺高血圧症）は有効な治療方法がない予後不良な疾患であり、創薬研究の進歩が望まれる。そのためには重症化に関与するバイオマーカーを特定する必要があり、当教室で作製している肺気腫合併肺高血圧症ラットモデルを用いてバイオマーカーの探索を行う。動物モデルにおける血清、肺組織の炎症性サイトカイン、ケモカインを測定するとともに、肺組織、肺動脈の細胞を単離し、RNAシークエンスを行うことで精度の向上を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

ラットに血管内皮成長因子（vascular-endothelial growth factor: VEGF）受容体阻害薬（SU5416）を投与し、6週間の低酸素曝露（酸素濃度15%）による3群肺高血圧症（肺気腫合併肺高血圧症）動物モデルを作製し、そのバイオマーカーについて検討した。オス Sprague-Dawleyラット（n = 8、生後4週齢；ジャクソンラボラトリージャパン) をコントロール群（n = 4）、3群肺高血圧症モデル群（n = 4）の2群に分け、3群肺高血圧症モデル群にSU5416を皮下注し（20mg/kg、day 1、8、15）、酸素濃度15%で6週間飼育した。初回のSU5416皮下注から6週後に肺血行動態の測定と解剖を行った。3群肺高血圧症モデルではコントロールと比較して、平均肺動脈圧の上昇と右室および左室・心室中隔重量比の増大を認めた、組織学的には同モデルでは気腔の開大を認めたが、肺動脈病変は肺動脈性肺高血圧症に特徴的な叢状病変（plexiform lesion）は認めず、Heath-Edwards分類でgrade 1-2度（中膜肥大から内膜増殖）にとどまっており、ヒトにおける肺気腫に合併した肺高血圧症の組織所見に類似していた。また、ウエスタンブロット法では3群肺高血圧症モデル群でコントロール群と比較してVEGFの発現低下と、活性型カスパーゼ3（cleaved caspase-3）の発現増加がみられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

3群肺高血圧症（肺気腫合併肺高血圧症）動物モデルを作製し、いくつかのバイオマーカーとなりうる蛋白についてウエスタンブロット法を用いて検討することができた。SU5416投与と6週間の低酸素環境下での飼育により順調に動物モデルを作製し、評価が可能となった。実験開始から血行動態測定日まで低酸素環境で6週間、問題なくラットを飼育できており、ウエスタンブロット法、RT-PCR法など各種バイオマーカーについて測定できる環境は整っている。

Strategy for Future Research Activity

VEGFや活性型カスパーゼ3の他に、IL-6（interleukin-6）やTNF-α（tumor necrosis factor-α）、TGF-β（transforming growth factor-β）などの炎症に関連する蛋白発現やRNA発現を調べる。さらに、アンジオゲニンやRhoキナーゼなど、肺動脈性肺高血圧症（1群肺高血圧症）の発症に関連が指摘されているバイオマーカーについても検討を進めていく。3群肺高血圧症動物モデルの肺動脈、肺組織の細胞を単離し、それぞれの細胞のmRNAを抽出して遺伝子ライブラリを作成し、RNAシーケンスを行うことでバイオマーカーとなる候補遺伝子を検索することを目指す。
また、肺動脈性肺高血圧症（1群肺高血圧症）の動物モデルを作製し、3群肺高血圧症モデルラットとの比較を行う。1群肺高血圧症動物モデルはAbeらの方法が既に確立されている。オスSprague-Dawleyラットにday 1にSU5416を皮下注し、酸素濃度10%の低酸素環境下で3週間飼育後、常酸素環境で10週間飼育する。同モデルと3群肺高血圧症モデルとの間で、前述のバイオマーカーの比較を行うことで両者が鑑別可能か検討する。