パクリタキセル耐性肺癌のmitotic slippageを標的とした新たな治療法の開発

• Project/Area Number: 23K07618
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 菊地 英毅 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (60463741)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: mitotic slippage / 薬剤耐性 / 非小細胞肺癌 / 非相同末端結合 / パクリタキセル

Outline of Research at the Start

本研究の目的は、パクリタキセル（PTX）耐性肺癌に対するNHEJ阻害を用いた新規治療法を開発することである。細胞分裂に関わるさまざまな分子を標的とした小分子化合物などでmitotic slippage自体を抑える試みはこれまで多く報告され、臨床試験に進んでいるものもあるが、成功しているとは言い難い。申請者らは、mitotic slippage自体を抑えるのではなく、slippageしたあとのDNA修復を標的とした治療法の開発を狙っている。新たな治療法を開発してPTX耐性を克服することでPTXが多用されるさまざまな悪性腫瘍の患者の予後を延長させることが期待できる。

Outline of Annual Research Achievements

非小細胞肺癌株として H1299，A549，H1975，H520 の 4 つの細胞株を用いた。H1299のパクリタキセル（PTX）IC50は他の細胞と比較して高く、PTX耐性であることが判明した。フローサイトメトリー法を用いてM期の細胞の割合を測定したところ、H1299では他の細胞株と比較してPTXによるmitotic arrestの効果が小さかった。M期の持続期間をタイムラプス顕微鏡を用いて測定しところ、H1299のPTX処理時のM期の持続期間は他の細胞株と比較して有意に短く、mitotic arrestに対するPTXの効果が減弱していることを示唆していた。さらに、mitotic slippageをした細胞をタイムラプス顕微鏡を用いて測定したところ、H1299ではPTX処理後にmitotic slippageが有意に多くなっていた。H1299に対するPTXとNHEJ阻害薬の併用による細胞死の詳細な評価のため、mitotic slippage後のPMDについて検討した。PTX単剤と比較して、A-196あるいはJQ1と併用した時にPMDが増加した。さらに、mitotic slippageからPMDまでの時間は、PTX単剤と比較してPTXとA-196あるいはJQ1の併用後に短縮した。以上の結果から、H1299はPTX耐性であり、PTX処理によりmitotic slippageが誘導されることが示された。
PTX感受性株であるA549をPTXに長時間暴露し、PTX耐性誘導株A549-PRを作成した。タイムラプス顕微鏡を用いて観察したところ、A549-PRではPTX処理後にmitotic slippageが有意に増加することを確認した。次にMTT法にて各細胞株に対するPTXのIC50を算出したところ、A549-PRにおいてA-196併用によりPTXのIC50が有意に低下した。このことからmitotic slippageがPTX耐性に直接関わっている可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初我々は、NHEJの抑制による抗腫瘍効果はパクリタキセル、ビノレルビンといった殺細胞性抗癌剤はM-G1期の細胞のDNAを傷害するため、特にNHEJ抑制が効果的だと考えた。しかし、予想に反して、NHEJ阻害はH1299細胞でパクリタキセルと相乗効果を認めるものの、その他の細胞では相乗効果はみられなかっ た。NHEJ阻害の方法として、各種DNAに対するノックダウンをおこなってみたが、NHEJが過去に報告されている程度に抑制されなかった。これは細胞株や実験環境の違いが原因として考えられた。そのため、標的DNAや至適濃度などを変更して実験をおこなっているところである。

Strategy for Future Research Activity

NHEJの抑制による抗腫瘍効果はパクリタキセル、ビノレルビンといった殺細胞性抗癌剤はM-G1期の細胞のDNAを傷害 するため、特にNHEJ抑制がその効果的だと考えた。しかし、予想に反して、NHEJ阻害はH1299細胞でパクリタキセルと相乗効果を認めるものの、その他の細胞で は相乗効果はみられなかった。今後NHEJ抑制を臨床応用して新たな治療法を検討するために、NHEJ阻害が有効となる細胞を同定するマーカーを発見したいと考えている。これまでの検討では、NHEJ抑制が効果がある細胞は、効果がない細胞と比較してパクリタキセルによるM期増強効果が弱い可能性が示唆されており、これにはmitotic slippageが関与しているのではないかと考えているが、NHEJを抑制するための分子の同定を行う必要があると考えている。