| Project/Area Number |
23K07732
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53040:Nephrology-related
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
松井 孝憲 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (10425233)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東元 祐一郎 久留米大学, 医学部, 教授 (40352124)
外川内 亜美 久留米大学, 医学部, 研究補助員 (60809177)
古賀 義法 久留米大学, 医学部, 助教 (70569433)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 糖尿病腎症 / アプタマー / 糖尿病性腎症 |
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| Outline of Research at the Start |
糖尿病の代表的な合併症である糖尿病性腎症の発症と増悪には、グリセルアルデヒド由来の終末糖化産物（GLA-AGEs）が関与している。しかしながら、複数の反応を経て生じるGLA-AGEsの修飾構造の実体と、受容体RAGEを介した生体作用については、不明な点が多い。そこでGLA-AGEsを構成する修飾体であるMG-H1、GLAP、APNに結合し、その作用を阻害する核酸医薬品であるDNAアプタマー（標的と特異的に結合する一本鎖DNA）を作成し、糖尿病モデル動物における腎症の抑制効果を検討する。本研究により、糖尿病性腎症の新規治療法が開発されると期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年は、培養腎メサンギウム細胞を用い、グリセルアルデヒド由来AGEs、GLAP、MG-H1、Argpyrimidine(APN)、ペントシジンの添加に伴う、in vitroアッセイをおこなった。各刺激物質の存在下で酸化ストレス産生や細胞増殖に対する反応を確認した。また、昨年度にMG-H1やAPNに対してSELEX法で作成した、各オリゴDNAを用い、上記のin vitroアッセイにおける抑制効果を検討した。酸化ストレスの検出はCarboxyH2DCFDA添加後の蛍光測定によりおこない、細胞増殖アッセイはWST-8添加後の吸光度測定によりおこなった。その結果、グリセルアルデヒド由来AGEs、GLAP、MG-H1存在下で、腎メサンギウム細胞由来の酸化ストレスの産生と、細胞数の減少が生じた。また、MG-H1、APN刺激時の炎症反応に関わる遺伝子発現と酸化ストレスに関わる酵素遺伝子についてもリアルタイム PCR法で検討した。その結果、グリセルアルデヒド由来AGEsとGLAP存在下でICAM-1, VAM-1, MCP-1遺伝子とNADPH oxidaseコンポーネントであるp22phox, gp91phoxのの発現増加が生じた。MG-H1刺激に伴う、遺伝子発現の増加はみられなかった。
グリセルアルデヒド由来AGEs、GLAP、MG-H1存在下における酸化ストレスと細胞増殖アッセイに対する各オリゴDNAによる抑制効果をで検討したところ、一部のオリゴDNAについて5~10%程度の抑制効果がみられたが、いずれも統計的な有意差は得られなかった。そこで、現在、別の候補オリゴDNAの再作成と、MG-H1による刺激条件の検討をおこなっている。
また、GLAP、MG-H1のELISA法による再現性と検出感度をおこなった。APNについては、検出感度が低かったため、抗体を変更して再度確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MG-H1培養細胞を用いたアプタマーの効果の確認について、MG-H1の刺激にともなう腎メサンギウム細胞の酸化ストレス産生と、細胞増殖の抑制効果は見られたが、リアルタイムPCR法による炎症関連遺伝子とNADPH oxidaseコンポーネント遺伝子の発現に対する効果はえられなかったため。また、MG-H1の刺激に伴う、酸化ストレス産生と細胞増殖に対し、オリゴDNAによる抑制効果が見られなかったため。上記の状況により、in vitroにおけるアプタマーのMG-H1の阻害効果が確認できていないと判断されたため、候補DNAアプタマーの再取得と、MG-H1刺激の条件検討が必要になった。また、MG-H1刺激に伴う、炎症関連遺伝子とNADPH oxidase遺伝子の発現についても、MG-H1添加時の濃度と刺激時間の検討をおこなっている。またAPNによる刺激については、酸化ストレスと細胞増殖に対する効果が見られなかったため、添加時の条件(APN濃度と刺激時間）の検討をおこなっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
腎メサンギウム細胞を用いたMG-H1刺激時の条件検討をおこなう。その際に、今回効果の一部が確認できなかった腎メサンギウム細胞以外にも、GLA-AGEsの受容体が発現しておりMG-H1等の評価が可能な、腎臓の近位尿細管細胞や、臍帯静脈内皮細胞を用いて検討をおこなう。それにより、腎糸球体以外の炎症以外にもGLA-AGEsが関わる糖尿病腎症に対する抑制効果の検討や、全身性の血管炎症の抑制効果について評価が可能になる。また、昨年度に取得したアプタマーの候補DNAのうち、今回検討をおこなったクローン以外の未検討クローンについて、in vtitro実験に使用可能なオリゴの作製をおこなう。また、追加で実施するin vitroアッセイの結果で阻害活性が得られない可能性も考えられるため、SELEX法による再度の作製おこない、候補DNAの追加をおこなう。新たに得られた候補DNAについては、実験の効率化をおこなうために、RAGEとの結合阻害効果の確認に先行して、in vitroアッセイをおこなう。In vitroアッセイで効果が得られたクローンについて、後にRAGEとの結合阻害効果を確認することで、MG-H1, APNの結合を実際に阻害するアプタマーをin vitroでセレクションし、候補をより多く得ることとする。
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