| Project/Area Number |
23K07773
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53050:Dermatology-related
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
林 周次郎 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (00599871)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井川 健 獨協医科大学, 医学部, 教授 (00372441)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2026: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | エーラス・ダンロス症候群 / siRNA / SNP / 3型コラーゲン / COL3A1 / ドミナントネガティブ効果 / 血管型エーラス・ダンロス症候群 |
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| Outline of Research at the Start |
これまでに当施設では約50名のvEDS患者を遺伝学的検査により診断している。そのうち，皮膚由来線維芽細胞が存在し，標的とする2つのSNPを有する患者を抽出し，その中からCDNのキャピラリーシークエンスにより、病的バリアントとSNPの位置関係が検出可能な距離に存在する，本実験に適した患者を特定する。
最終的な実験として研究対象細胞にsiRNAを導入して、ノックアウト効率の確認と共に、表表現型の改善（蛋白レベル、小胞体ストレスマーカーや他の蛋白質の遺伝子発現量、電子顕微鏡の細胞観察）をする。
期待される効果は，優性阻害効果を回避しハプロ不全化の誘導である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究に最終的な結果は、にCOL3A1の対立遺伝子の片方の病的変異をノックアウトすることにより、表現型の改善が見られるかどうかである。表現型は細胞の観察、とくに小胞体ストレスの改善と、3型プロコラーゲンの発現量で評価する。まず、必要なのは血管型エーラス・ダンロス症候群（vEDA）と疾患陰性コントロール群の比較である。
本年度では、これまで当院で診断したvEDS患者、約50名のレジストリの作成を行った。遺伝子変異の種類と、今回の研究のノックアウトのターゲットにしているSNPの有無と、遺伝子変異の位置関係を登録した。さらに、3型プロコラーゲンの発現量、カルテ情報（性別、年齢、臨床症状について）も登録した。同様に疾患陰性コントロールについては、COL3A1に遺伝子変異を認めていことを確認できている約70名のサンプルの、カルテ情報をレジストリに登録した。
vEDSでは電子顕微鏡による、膠原線維束の観察により膠原線維束の大小不同のを認めている。膠原線維束の観察は、本補助研究でのアウトカムにはしていないが、膠原線維束の形態異常と、小胞体ストレスには関連性があることが示唆されている。膠原線維束の大小不同を、変動件数で定量化しレジストリに登録した。同様に新患陰性コントロールについても膠原線維束を観察し、変動係数を算出して比較した。これまでの報告よりも、サンプルサイズは大幅に多く、さらに膠原線維束と小胞体ストレス、患者の症状の発現系の違いについてを、昨年度に報告した。（Front Genet. 2023 doi: 10.3389/fgene.2023.1238209.）
次年度は、COL3A1上にあるsiRNAの標的SNPに、特異的に反応してノックアウトを誘導し、SNPを含まない対立遺伝子には影響がすくない、siRNA鎖を設定し、実際に患者由来の培養皮膚線維芽細胞に導入する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
患者レジストリの作成は非常に時間がかかる作業であったが、論文報告（アクセプト）に至るまで、完成されたものを作成することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、遺伝子、細胞を扱う機会が増えると思われる。siRNAの設計には時間がかかると思われるが、設計されたsiRNAの導入による細胞の表現型の評価がより重要になってくる。
疾患群とコントロール群での小胞体ストレスの評価方法、3型プロコラーゲンの発現（定量化）についても、検討していく予定である。
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