血管透過性亢進病態における血管外凝固第IX因子の役割解明

• Project/Area Number: 23K07842
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 坂田 飛鳥 奈良県立医科大学, 医学部, 助教(共同研究講座) (90528457)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2026: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 血管透過性亢進 / 血管外凝固因子 / 血管外凝固 / 血管外凝固第IX因子 / アレルギー / 炎症

Outline of Research at the Start

血液内の液性成分は血管壁を透過して血管外で機能を果たしている。この透過性を生体は周囲環境や病態にあわせて変化させているが、その制御機構は未だ明らかでない。本研究では血管透過性制御に血栓を形成する反応、特に血栓形成の重要なタンパク質の一つで血管外にも存在している凝固第凝固第IX因子が重要な役割を果たしているのではないかと考え、その役割を生きているマウス体内をそのまま観察する手法を用いて解析する。血管透過性の制御機構を明らかにすることで、強いアレルギー反応や炎症病態を背景に起こる、近年COVID19感染症でもみられたような急激な呼吸不全などの病態の新規治療法構築を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

野生型マウスに種々の分子量の蛍光色素を結合させたデキストランを投与し、血管を透過する分子量の評価を生体内で行うことのできる系を構築した。また、蛍光色素を結合させたフィブリノゲンを静脈注射することで凝固が起こる場所の可視化を可能とした。観察血管としては、マウス大腿および精巣表面の血管を用いた。静脈系ではかなり大きい分子量のデキストランも透過があり、ヒスタミン刺激による透過度合いの変化を確認するためには動脈系が最適と考えられた。ヒスタミン投与後には出血が起きていないにも関わらず血管内から血管外へのフィブリノゲンの漏出が確認され、血管周囲でフィブリンを形成する様子が観察された。凝固第IX因子の欠損マウスは開発者の先生の許諾を得た後、理研BRCで個体化を行なってもらい、研究施設への搬送を行なった。homo、hemiとして提供を受けたため、初期のタイピングの必要性は回避でき、繁殖する個体数も削減ができると考えられたが、一方で一世代目の繁殖では産後の死亡や妊娠がうまくいかない例が多発し、結果として系統維持に必要なマウス数を増やすこととなった。このため、実験に使用できる凝固第IX因子欠損マウスが少なく、定量評価手法の確定には至っていない。繁殖に適さないと判断されたマウスを用いた検討では凝固第IX因子欠損マウスではヒスタミン投与前から少量の高分子量デキストランの漏出が確認され、さらにヒスタミン投与後には野生型と比して漏出率が多い可能性があった。凝固第IX因子欠損マウスではヒスタミン投与前の静脈系で血管外漏出が強い可能性があり、今後動脈系だけでなく、静脈系でも評価を行う予定としている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

凝固第IX因子欠損マウスの繁殖に際し、妊娠が成立しない個体や産後の産仔死亡が多発した。また、個体識別のマーキング後に原因不明ではあるが、死亡する個体があった。このため実験に使用できる個体を十分に得ることができなかった。
一方、野生型マウスを用いて行なった評価系の構築に関しては順調に進み、検査・定量化手法の再検討は一部で必要となっているものの今後解決が可能と考えている。ただし、野生型マウスに行なったヒスタミン刺激は投与直後の状態悪化が顕著であり、現在の条件でも予備検討結果には差を認めているが、今後検討を重ねるためには最適な投与濃度の調整を行う必要性があると考えている。

Strategy for Future Research Activity

野生型マウスを用いてヒスタミン投与法の最適化を行う。また、定量化手法の確立を凝固第IX因子欠損マウス実験に先行して行う。凝固第IX因子欠損マウス実験は繁殖から外れたマウスを用いて開始し、野生型マウスでは決定しきれない観察血管の確定やヒスタミン投与量などの条件を調整する（凝固第IX因子欠損マウスで投与後の状態悪化がひどい時には凝固第IX因子欠損マウスを指標に決定を行う。）。条件が確定した時点で凝固第IX因子欠損マウスを一定数確保して実験を行う。繁殖維持に関しては飼育施設で割り当てられている使用可能ケージが限られており、こちらの拡大も管理者に要求していく。