| Project/Area Number |
23K07845
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
脇田 知志 日本医科大学, 医学部, 准教授 (70465350)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中嶋 亘 日本医科大学, 医学部, 講師 (40557500)
山口 博樹 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (90297937)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | DNMT3A変異 / DNA修復機構 / RAD51 / 急性骨髄性白血病 |
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| Outline of Research at the Start |
実験１）レンチウィルスベクターを用いたDNMT3A-R882H変異遺伝子導入細胞の作製（１年目）
実験２）AML細胞株におけるRAD51阻害後のG2/M期延長ならびに細胞死抑制の責任経路の探索（１年目）
実験３）CpG領域のDNAメチル化解析による責任遺伝子の同定（２年目）
実験４）責任経路・責任遺伝子への標的治療とその有用性のin vitroでの検討（３年目）
実験５）Xenograft modelを用いた責任経路・責任遺伝子への標的治療の有用性の検討（３年目）
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNMT3A変異陽性AMLに生じるG2/M期の遺伝子発現異常とその機序を解明するためにウィルスベクターを用いた遺伝子改変細胞の作製を行った。
野生型DNMT3Aタンパクはダイマーを形成して機能するためDNMT3A変異はその過剰発現によってdominant negativeに低下させることが知られている。また別の報告では、DNMT3A変異タンパク自体にも野生型にはない機能が獲得される可能性が指摘されている。これらの報告をもとに、①CRISPR-CAS9システムを用いたレンチウィルスベクターによるDNMT3Aノックアウト細胞の作製・樹立、②レンチウィルスベクターによるDNMT3A-R882H変異遺伝子導入細胞の作製・樹立を行った。 ①についてはDNMT3A変異陽性細胞株であるOCI-AML3, DNMT3A野生型細胞株であるHL60, THP1細胞を対象としてDNMT3A遺伝子のノックアウトを実施し、DNMT3A遺伝子ノックアウト細胞の樹立に成功した。②については、DNMT3A野生型細胞株であるHL60, THP1, MV4-11を対象としたDNMT3A-R882H変異体の遺伝子導入を行い、現在までにHL60, THP1での遺伝子導入に成功した。
①においてはGFP標識を、②についてはPuromycinによる選択を行ったがウィルスの導入効率が低いことから、コンタミネーションが多く発現解析や薬剤投与試験が困難と推定された。そのため、現在ゲル培地を用いたコロニーピッキングを行い、コンタミネーションを除外、均一なクローンを作成し培養を行っている。今後 ①、②の細胞を対象としたH2AXの発現の観察、RAD51阻害（BO2、si-RAD51）への反応性を評価し、G2/M期延長が生じ
るか否かをCell cycle assay (PI法)を用いて評価する計画で有る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
浮遊細胞の遺伝子導入効率は低く、またDNMT3Aノックアウトした細胞は増殖力が低下することからセレクション過程においてコンタミネーションが多く発生するなどの問題が発生した。このため、遺伝子組み換え細胞の作製・樹立に時間がかかり進捗に遅れが生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在は、導入効率を上げるためウィルス濃縮の技法を導入、さらに効率的に薬剤セレクションをかけ増殖力の強いクローンを選択するためにゲル培地をもちいたコロニーピッキングの手法を採用し対応している。この技術により遺伝子組み換え細胞の作製・樹立の効率は改善しており、今後の研究の推進が期待できる状況にある
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