Localization and functional analysis of V2 vasopressin receptor in ECFC to elucidate the mechanism of VWF secretion
| Project/Area Number |
23K07856
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
松下 正 名古屋大学, 医学部附属病院, 教授 (30314008)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 伸明 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (70637686)
岡本 修一 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 助教 (80899675)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | 血液学 / von Willebrand因子 / factor VIII / ECFC / DDAVP / バソプレシンV2受容体 / V2R / von Willebrand factor / Glycoprotein Ib / Factor VIII / Vasopressin / Endothelial cell |
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| Outline of Research at the Start |
DDAVP刺激による血管内皮細胞(EC)からのVWF分泌の詳細なメカニズムについてはほとんど検討が進んでおらず、ECのV2受容体（V2R）に結合し、cAMPを介した細胞内情報伝達機構によりVWFの分泌刺激となると、HUVECにV2Rを強制発現させた検討により理解されており、異論が多い。今回DDAVPを健常人・患者由来ECFCに添加、選択的V2RアンタゴニストTolvaptanの存在/非存在下でその刺激メカニズムを明らかにし、cAMP依存性のVWFのWeibel Palade小体からの放出を観察、患者ごとに異なるDDAVPに対する反応性の差を直接患者由来ECFCで検討、治療効果を予測する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト末梢血単核球から樹立されるendothelial colony forming cell (ECFC)は，血管内皮細胞のex vivoモデルであり，von Willebrand因子 (VWF)の発現状態を生体外で再現することを可能にする。本研究では，VWD患者由来のECFCを用いて，酢酸デスモプレシン (DDAVP)によるVWF分泌刺激作用を細胞のレベルで多角的に検討する．
まず，ECFCにおけるバソプレシンV2受容体 (V2R)の発現について一定の見解は得られていないため，それを確認することが実験系の確立に必須である．そこでECFCにおいて逆転写PCR (RT-PCR)，Western blotting (WB)，免疫染色によりV2Rの検出を試みた．陽性対照としてはヒト肺微小血管内皮細胞 (HPMEC)を，陰性対照としてヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)を用いた．RT-PCRとWBの結果から，ECFCにもmRNA，蛋白質レベルでV2Rが発現していることが示された．免疫染色標本の共焦点顕微鏡観察によってもECFCにおけるV2R発現が確認されたが，ECFCではHPMECよりもその発現強度は低かった．
今年度にかけて，実際にVWD患者のECFCからのVWF分泌を評価するために，添加するDDAVPの至適濃度と作用時間を検討している．マルチウェルプレートの面積と，播種細胞数，DDAVP濃度の調整によって，再現性の高いアッセイ系の確立を行っている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予備的な検討としてECFCにおけるバソプレシンV2受容体 (V2R)の発現について確認することが実験系の確立に必須であった．岡本とともにECFCにおいて逆転写PCR (RT-PCR)，Western blotting (WB)，免疫染色によりV2Rの検出を試み、RT-PCRとWBではECFCにもmRNA，蛋白質レベルでV2Rが発現していることを確認した．免疫染色標本の共焦点顕微鏡観察によってもECFCにおけるV2R発現が確認されたが，ECFCではHPMECよりもその発現強度は低かったため．
今年度にかけて，実際にVWD患者のECFCからのVWF分泌を評価するために，添加するDDAVPの至適濃度と作用時間を検討している．ここまで計画範囲内で推移できていると考えている
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の検討によって，mRNA，蛋白レベルでECFCにおけるV2Rの存在が明らかとなった．実際に，VWD患者由来ECFCにおけるDDAVP反応性を検討していくにあたり，ECFCに添加するDDAVPの至適濃度とその反応時間を検討する必要がある．これらの条件を最適化した上で培養上清中へのVWF分泌を定量する。定量にあたっては高感度enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)による上清中VWF濃度の測定を実施する．また，V2R拮抗薬存在下でのVWF分泌の変化を検討し，ECFCにおけるVWF分泌に対するV2Rの機能を明らかにしていく．
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Report
(1 results)
Research Products
(25 results)
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[Presentation] 患者由来endothelial colony forming cell(ECFC)を用いたVWF欠損状態における血管新生能の評価2023
Author(s)
岡本 修一, 鈴木 伸明, 田村 彰吾, 兼松 毅, 鈴木 敦夫, 鈴木 奈瑠子, 川口 裕佳, 清井 仁, 小嶋 哲人, 松下 正, 早川 文彦
Organizer
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[Presentation] 血友病患者における抗血小板療法の現状 当施設での経験2023
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Organizer
第45回日本血栓止血学会学術集会
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