| Project/Area Number |
23K07991
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54040:Metabolism and endocrinology-related
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
馬場 崇 九州大学, 医学研究院, 准教授 (40435524)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 副腎皮質 / 男性ホルモン / Ad4BP / 副腎 / グルココルチコイド / 性差 / SF-1 / Nr5a1 / 骨格筋 |
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| Outline of Research at the Start |
近年、様々な生命現象に性の影響が見出され、性の成立機構の理解が重要な研究課題と位置付けられている。従来、精巣と卵巣から放出される性ホルモンが全身の器官に直接作用することで個体の性が確立すると理解されてきたが、その作用機序には不明な点が残る。最近の申請者の研究成果は、性ホルモンは副腎におけるグルココルチコイドの産生制御を通じて、骨格筋の形態・性質に性差をもたらすことを示唆した。本研究では、男性ホルモンが副腎における転写因子Ad4BPの発現抑制を通じてグルココルチコイドの産生および血中への放出を抑制すること、そしてその結果骨格筋のオス化を誘導すること示す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、男性ホルモンが副腎皮質束状層（zF）細胞において転写因子Ad4BPの発現を抑制し、グルココルチコイド産生を低下させる機構、およびそれによって誘導される骨格筋の“オス化”現象の解明を目的としている。zF細胞におけるAd4BP遺伝子の発現を制御するエンハンサー候補3領域のうち2領域についての欠失マウスとF1世代の作出を完了し、残り1領域の欠失マウスも作出中である。また、zF特異的にCREリコンビナーゼを発現するCyp11b1‑Creトランスジェニックマウスを作出し、ノックインF0個体3匹と、F1世代2系統を得て、Ad4BP‑floxマウスとの交配によるzF特異的Ad4BP KO系の樹立基盤を確立した。今後は3領域の欠失マウスを用いてAd4BPの発現量を定量解析し、ChIPまたはCUT&RUNでARの直接結合の有無を検証する。直接結合がない場合はエンハンサーの塩基配列から転写調節因子を予測し、ARによる発現制御や、ARとのタンパク質相互作用について検討する。また、Cyp11b1‑Cre:CAG‑CAT‑EGFPマウスでzF特異的EGFP発現を確認後、zF特異的Ad4BP KOマウスを作出し、骨格筋形態学的解析、解糖活性測定、ミトコンドリア機能解析を行い、グルココルチコイド低下による骨格筋オス化メカニズムを総合的に解明する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究項目①：男性ホルモンによる副腎zFにおけるAd4BP発現抑制を介したグルココルチコイド産生抑制機構
これまでに、男性ホルモンが副腎皮質束状層（zF）細胞内で転写因子Ad4BPの発現を低下させ、その結果グルココルチコイド産生が抑制されることを明らかにしてきた。男性ホルモンはアンドロゲン受容体（AR）を介して機能するため、ARがどのようにAd4BP遺伝子発現抑制を誘導するかを解明する必要がある。そこでまず、Ad4BP遺伝子の発現を制御するシス・エレメント（エンハンサー）を同定すべく、初年度に得られた３か所のエンハンサー候補領域それぞれを欠失するゲノム編集マウスを作製した。現在までに２領域の欠失マウスおよびF1世代の作出を完了し、残る１領域の欠失マウスは作出中である。
研究項目②：Ad4BP発現低下に伴うグルココルチコイド減少が誘導する骨格筋のオス化
副腎zF特異的Ad4BPノックアウト（KO）マウス作出に向け、zF細胞特異的な発現が知られるCyp11b1遺伝子制御下でCreリコンビナーゼを発現するCyp11b1 Creマウスを作出した。現在、期待通りにノックインが確認された個体が３匹得られ、そのうち２匹からF1世代を作出済みである。これによりAd4BP-floxマウスとの交配によるzF特異的Ad4BP KOマウス作出の基盤が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究項目①：エンハンサー機能とAR結合の検証
まず残り１か所のエンハンサー候補領域欠失マウスを完成させ、３領域それぞれのエンハンサー欠失マウスを用いてAd4BP発現量の定量解析を行う。これにより、真のエンハンサー機能を有する領域を同定する。次に、その領域におけるARの直接結合をChIPまたはCUT&RUN法で検討し、直接結合の有無を判断する。もしARの直接結合が認められない場合は、当該エンハンサー領域の塩基配列からその領域に結合する転写調節因子を予測し、その因子をコードする遺伝子がARによって発現制御を受ける可能性をqPCR等で評価する。また、ARと転写調節因子の物理的相互作用を共免疫沈降法により検証し、タンパク質レベルでの調節機構についても検討を行う。これらの結果を統合することで、Ad4BP発現抑制を介したグルココルチコイド産生制御の分子基盤を解明する。
研究項目②：骨格筋オス化機構の解析
まず、Cyp11b1 Cre:CAG CAT EGFPダブルトランスジェニックマウスにおいて、副腎zF細胞特異的にEGFPが発現することを確認する。次に、このCyp11b1 CreマウスとAd4BP-floxマウスを交配し、副腎zF特異的Ad4BP KOマウスを樹立する。得られたKOマウスにおいて、骨格筋の形態学的変化を組織学的解析で評価するとともに、解糖活性やミトコンドリア機能をフラックスアナライザーにより解析し、性差を含めたエネルギー代謝の変動を明らかにする。最終的に、グルココルチコイド低下による骨格筋オス化の分子機構を網羅的に解析し、ホルモン依存的性差形成メカニズムの新規知見を得る。
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