| Project/Area Number |
23K08010
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54040:Metabolism and endocrinology-related
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
寺坂 友博 岡山大学, 大学病院, 助教 (80721935)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | ゴナドトロープ細胞 / 下垂体 / RNA結合タンパク / ZFP36 / mRNA代謝 / ルシフェラーゼレポーターアッセイ |
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| Outline of Research at the Start |
女性不妊の原因で最も高い割合を占める排卵障害には、性腺内分泌制御を行う下垂体のゴナドトロピン(LH, FSH)分泌異常による続発性性腺機能低下症が最も多い。よって、その原因を探索することは、内分泌学的に重要な課題である。ゴナドトロープのゴナドトロピン分泌関連遺伝子mRNAには3’非翻訳領域(3’UTR)にRNA結合タンパクが結合するAU-リッチ領域(ARE)が共通して存在する。生殖内分泌機能不全の原因解明および治療応用として期待されるゴナドトロピン分泌制御を解明するため、AREに結合するRNA結合タンパクに着目し、ZFP36によるパルス状のゴナドトロピン分泌応答性のメカニズムについて検討する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
RNA結合タンパクであるZinc Finger Protein 36 Homolog (ZFP36)は、mRNAのAU-リッチ領域(AU-rich element; ARE)に特異的に結合しmRNAの代謝を促進させる。性腺ホルモンを制御する下垂体ゴナドトロープ細胞においてZFP36タンパクはGnRH刺激により発現が増加し、AREを有するmRNA発現量の調整に関与していると考えている。レンチウイルス粒子トランスダクションにより作出した、ZFP36過剰発現安定発現株(ZFP36-FLAG-LβT2)を用い、AREを有するゴナドトロピン関連mRNAの3’UTRを組み込んだルシフェラーゼレポータープラスミド(pmirGLO)によりコントロール株とZFP36高発現株のルシフェラーゼ活性を対比し、ZFP36によるmRNA代謝作用の検討を進めた。Egr1 3’UTRのAREを含む箇所ごとに短縮したプラスミドを用いたルシフェラーゼ活性で、899-1006間, 607-899間および1-474間で活性のステップアップを認め、各々のARE変異配列を含むレポータープラスミドを作製しルシフェラーゼ活性を検討した。1-474間のARE変異で特にルシフェラーゼ活性の増大を認め、同部位がEgr1 3’UTRにおけるZFP36の作用部位であることが示唆された。
ZFP36はゴナドトロピン分泌調節に関与しAREを有するmRNAの分解調節に直接的に作用することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Gnrhr-Cre×ZFP36-floxマウス（ゴナドトロープ特異的ZFP36ノックアウトマウス）を作出するために、ZFP36-floxマウスをカリフォルニア大学アーバイン校より譲り受けたが、親マウスに細菌のコンタミを起こしていたため一度胚凍結・胚移植処置を施してからかけ合わせる作業が必要となり、最終的にGnrhr-Cre×ZFP36-floxマウス（ヘテロ）が得られたのは2024年3月頃となったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
Gnrhr-Cre×ZFP36-flox（ヘテロ）マウスからかけ合わせることによるホモマウスの作出を行い、雌マウスの性周期の変化や雄雌の繁殖能力の有無、GnRH刺激によるゴナドトロピン分泌の反応性の変化の検討をスムーズに行えるようにする。その間に、CRISPR-Cas9システムを用いたトランスフェクションと蛍光セルソートにより作製したZFP36ノックアウトLβT2細胞株のGnRH反応性およびLH産生について検討を進める。
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