Uncovering the maturation process of the pituitary hormoen, ACTH.

Research Project

Project/Area Number	23K08016
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 54040:Metabolism and endocrinology-related
Research Institution	Dokkyo Medical University
Principal Investigator	佐藤元康獨協医科大学, 医学部, 助教 (20418891)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	杉本博之獨協医科大学, 医学部, 教授 (00235897)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000) Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	下垂体腫瘍 / オートファジー / ACTH / ペプチドホルモン / pituitary / hormone / peptide / secretion
Outline of Research at the Start	下垂体ホルモンACTHは前駆体タンパク質POMCとして転写・翻訳されたのちに、前駆体のまま、あるいは切断などを経た成熟型のいずれかとなって分泌される。しかし、これらの経路がどのように選択されるのかについて、また経路の相互的な関わりについては不明な点が多い。そこで、本研究ではホルモン前駆体の運命決定の分子メカニズムを明らかにする。経路選択の異常は下垂体ACTH産生腫瘍で観察される過剰なホルモン産生や、異所性ACTH産生腫瘍における不完全なACTH関連ペプチドの生成を引き起こしているものと考えられ、本研究の成果はクッシング症候群の治療戦略へ向けた新規のアプローチを提供する。
Outline of Annual Research Achievements	ホルモン分泌小胞の分離と解析：ACTH前駆体タンパク質POMCとEGFPの融合タンパク質をマウス下垂体腫瘍細胞株AtT-20に遺伝子導入すると、細胞質に顆粒状の局在パターンとして観察された。これらの顆粒構造はACTH抗体を用いた細胞免疫染色像と重なることから、ACTH分泌小胞であると考えられる。さらにホルモン分泌小胞を輸送するタンパク質として知られているRab3のEGFP融合タンパク質をAtT-20に遺伝子導入し、GFP-affinity beadsによりRab3被覆分泌小胞を精製した。この精製小胞画分についてウェスタンブロットをおこなったところ、実際にACTHの存在を確認することができた。今後は他の分泌小胞マーカータンパク質も含めて小胞精製を進め、POMCからACTHへプロセッシングされる過程と、それに対応する輸送小胞の対応関係を詳細に明らかにしていく。細胞レベルにおけるホルモン合成の解析：課題申請時にACTHのプロセッシングに関与する分子候補のひとつとしてPLD3を得ていた。本年度はAtT-20細胞においてPLD3のノックアウト細胞を作製した。この細胞ではPOMCとその中間体ペプチドの量の上昇と同時にACTH低下がみられることから、PLD3がPOMCからACTHへのプロセッシングに大きな役割をもっていることが示唆された。現在、PLD3の細胞内局在や相互作用するタンパク質の同定を試みている。論文報告：AtT-20細胞においてオートファジーを阻害すると細胞増殖とACTH産生が低下することを示した。また、化学療法に用いられるテモゾロミドとの2剤併用によって阻害効果が増強されることを示し、クッシング病への適用可能性を実証した。この結果をもとに、オートファジーとACTHのプロセッシングの関わりついて研究を進行中である（Satou M. et al., MCE, 2024)。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度の研究により、既知のACTH分泌小胞マーカータンパク質（Rab3）を足がかりとして、細胞内に形成されるホルモン分泌小胞を非破壊的に取り出すことに成功している。今後はこの手技を用いて他のマーカータンパク質（クラスリン、Rab5等）についても同様の実験を重ねることで、ACTH分泌小胞の成熟とACTHプロセッシング状態の対応関係を詳細に知ることが出来る。また、遺伝子ノックアウトの実験から、PLD3がPOMCからACTHが生成されるホルモン成熟過程に深く関与していることが示された。しかし本タンパク質の分子機能は不明であることから、PLD3の細胞内局在を調べることと並行して、PLD3と相互作用するタンパク質の同定をおこなっている。現在までに幾つかの小胞輸送タンパク質がPLD3結合因子として見つかりつつあり、生化学的な検証実験をおこなっていく計画である。以上のように研究計画通りに実験成果が得られている一方で、オートファジーがACTHを大量に産生する仕組みを支えていることを実証し、国際内分泌専門誌にて発表した。しかし、オートファジーが恒常的にACTH産生のためのエネルギーを供給している仕組みは不明であり、ACTH分泌小胞の成熟におけるオートファジー関連タンパク質の関与についても調べる意義は高いと思われる。今後はこれらを考慮しながら計画を遂行していくことで、下垂体腫瘍におけるホルモン過剰産生メカニズムの全体像に近づける可能性が大きい。
Strategy for Future Research Activity	実験手技上の課題解決：実績の項で示した通り、現在までのところ分泌小胞の分離にはGFPに対する抗体ビーズを用いて濃縮している。この方法の利点は蛍光顕微鏡下で生細胞でのGFP融合マーカータンパク質の発現レベルや局在を事前に確認できる点にある。しかし、一方でGFP抗体ビーズは高価であるため、今後のスケールアップに際しては研究費を圧迫することが予想される。そのため、過去の類似研究を参考に、比較的安価であるヘマグルチニン（HA）エピトープによる分泌小胞の分離・精製を試みる予定である。GFPと並行して使い分けることでコストと収量のバランスを鑑みながら実験を進める。なお、すでにFLAGエピトープについて試みたが収量が低いため、このエピトープを用いた実験は中止している。課題の伸展：本年度に受理された原著論文（Satou et al., MCE, 2024）で示した通り、下垂体腫瘍細胞は大量のACTH産生のためにオートファジーに依存していることが明らかとなった。これは本課題提案のきっかけとなった発見を実証した成果である。「POMCからACTHへのプロセッシング経路の解明」が引き続き本課題の中心テーマであることには変わりはないが、オートファジーがPOMC合成の主要なエネルギー源であると仮定した場合、そもそもオートファジーの基質がどこから供給されているのかという問題が立ち上がってくる。この点については、分泌小胞の質的・量的な変化に注意を払いながら、「ACTH産生量とオートファジー」についても分子機構を明らかにしていきたい。