| Project/Area Number |
23K08022
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
深井 原 北海道大学, 医学研究院, 特任講師 (60374344)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
暮地本 宙己 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60632841)
亀田 浩之 北海道大学, 歯学研究院, 助教 (70829887)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 臓器灌流 / 肝移植 / 虚血再灌流 / pH / 機能評価 / 温度 / 移植 / 機械灌流 |
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| Outline of Research at the Start |
重水と水素ガスの生物活性を主体とする臓器灌流・修復の新しい方法論の有効性をラット肝の冷保存、機械灌流、単離肝灌流モデルで検証する。種々の灌流温度における至適pHを明らかにし、臓器灌流の温度－至適pH 関係を明らかにする。重水含有液の効果、作用点を解析する。細胞・臓器の容積変化を水分子の挙動から解析し、浸透圧変化と臓器容積変化がグラフト機能に及ぼす影響を生化学的、超微形態的に評価する。同位体水の細胞内外への動きを同位体顕微鏡で追跡し、アクアポリンとGap junctionを介した水移動の温度依存・非依存性、D2O/HDOの移動における同位体効果を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度にラット肝実質細胞株 (RL-34)、ラット肝星細胞株 (RI-T)を用いた低温灌流を模倣した細胞実験を実施した。2024年度は、ラット肝マクロファージ細胞株 (HS-P)を検討する細胞に追加した。肝細胞株、肝星細胞株、肝マクロファージ細胞株を、pH 6.8～8.2に調整したUW-MP液内で、大気下、7℃で静置することで低温灌流時の臓器内の環境を模倣した。また、通常培養に戻すことで移植後の再灌流を模倣した。肝細胞、肝星細胞は酸性環境に弱く、高pH域で細胞障害が軽減されたが、肝マクロファージは2つの細胞とは異なり、低温灌流模倣終了時, 復温後3時間、共に低温灌流模倣時のpHが低い時にViabilityが有意に高く、細胞障害は有意に抑制され、酸性環境に耐性があると考えられた。一方、肝細胞と肝マクロファージの共培養および肝細胞と肝星細胞の共培養では、低温灌流模倣時のpHが高い時にViabilityが有意に保たれた。これらの結果から、肝構成細胞はpHの影響、あるいは、許容範囲が細胞種によって異なることが明らかになった。
ラット肝の灌流実験も継続した。ラット肝臓の48時間冷保存後に、UW-MP液による27℃の体外灌流 (3時間) を実施した。UW-MP液はpH無調節、および、pH7.2～7.8とし、単離肝灌流装置で37度に復温・再灌流した。再灌流時の胆汁産生量、酸素消費率、灌流液中逸脱肝酵素活性等を評価し、27℃灌流における至適pHが概ね定まった。現時点で明確な結論を記載できないが、灌流液や肝組織を用いた種々の解析に着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
動物実験施設の閉鎖、実験室移動等の不慮の事態が発生し、動物実験ができない期間が生じたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞実験では、肝マクロファージの活性を中心に精査する。特に、M1, M2マクロファージの割合を明らかにし、pHがマクロファージクラススイッチ与える影響を明らかにする。すなわち、灌流時のpHがマクロファージクラススイッチを介してグラフトの機能、障害に関与する可能性をin vitroで探索する。ラット肝を用いた実験では、より良く保存された肝臓と、そうではない肝臓を対比し、27℃灌流、あるいは、単純冷保存がクッパー細胞のクラススイッチに与える影響を免疫染色で評価する。さらに、灌流液や肝臓などの採取された試料を用いた解析を進める。HE染色、TUNEL染色、4-NE-protein adduct染色などに加え、灌流液や肝組織中のヌクレオシド、フラボノイドをHPLC蛍光検出法、PDA検出法により検討する。
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