| Project/Area Number |
23K08184
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
佐々木 勝則 北海道大学, 医学研究院, 学術研究員 (60336394)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平野 聡 北海道大学, 医学研究院, 教授 (50322813)
土川 貴裕 北海道大学, 大学病院, 講師 (50507572)
七戸 俊明 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (70374353)
中村 透 北海道大学, 医学研究院, 助教 (70645796)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | 遺伝子治療 / ヘプシジン / 食道癌 / レトロウイルスベクター |
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| Outline of Research at the Start |
食道癌の治療として、EMR-C法やESD法の内視鏡的治療法、胸腔鏡・腹腔鏡を用いた低侵襲外科治療法、5-FU/シスプラチン点滴による化学療法、化学療法と放射線を同時に行う化学放射線療法、免疫チェックポイント阻害剤と化学療法との併用などがあり、高度進行食道癌に対して集学的治療法が試みられている。しかし食道癌の①隣接臓器浸潤、②広範のリンパ節転移、③癌血行性転移が根治治療を難しくしている。そこで転移が拡がった進行食道癌に対する新しい治療戦略の開発が重要である。ウイルスを応用した遺伝子治療は有効な手段のひとつとして長年その可能性が追及されてきた。
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| Outline of Annual Research Achievements |
転移が拡がった進行食道癌に対し、免疫チェックポイント阻害剤を化学療法と併用することで治療成績が向上したが、その効果は十分なものではない。 そこで、ウイルスを応用した遺伝子治療法が有効な手段のひとつとなりえると考え、その可能性を追求した。令和6年度は高い遺伝子導入効率を達成するため、治療遺伝子による腫瘍溶解性（oncolytic）を抑制するため、IRESを利用した恒常的発現系に代わり、誘導型遺伝子発現システムcis-acting promoterを構築した。具体的には、制御システムとしてglucocorticoid-response element（GRE）をタンデムに配列し、コンパクトかつパワフルなプロモーターとしてアデノウイルスのmajor late promoter（AdMLP）を選択した。PCRにて5×GRE fragment およびAdMLP fragmentを増幅し、腫瘍選択的増殖レトロウイルス・ベクター(RRV)に組み込んだ（RRV-5×GRE-AdMLP）。ヒト食道扁平上皮癌細胞株TE-8に対するRRV-5×GRE-AdMLPの感染・拡散効果とデキサメタゾン誘導活性を示すため、cis-acting promoterの下流にemerald GFP cDNAを導入したRRV-5×GRE-AdMLP-GFPを作製し、GFP陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した。0.01 M.O.I.で感染を開始（day 0）し3、6、10、13、18、21日後に100nMデキサメタゾンを投与し、24時間後のGFP陽性率は、それぞれ1%、3%、12%、41%、83%、90%を示した。腫瘍溶解性を回避した誘導型遺伝子発現システムcis-acting promoterを搭載した腫瘍選択的増殖レトロウイルス・ベクターの構築に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．高い遺伝子導入効率を達成するため、治療遺伝子による腫瘍溶解性（oncolytic）を抑制することが必須であることから、glucocorticoid-response element (GRE)を利用した誘導型遺伝子発現システムを考えた。制御システムとしてGREを5個をタンデムに配列し、その直下にコンパクトかつパワフルなプロモータとしてアデノウイルスのmajor late promoter（AdMLP）を連結したcis-acting promoter (5×GRE-AdMLP) を構築した。このcis-acting promoter を腫瘍選択的増殖レトロウイルス・ベクター(RRV)に組み込み、さらにcis-acting promoterの機能評価を目的としてプロモータ下流にemerald GFP cDNAを配置した（RRV-5×GRE-AdMLP-GFP）。Emrald GFPの発現をデキサメタゾン添加（cis-acting promoterの活性化）で誘導できることを確認した。
２．より強力な制御システムのプロモータとして、5×GRE-AdMLPに対してさらにGRE 5個をタンデムに追加した10×GRE-AdMLPを作製した。今後、このcis-acting promoterの有効性を示す。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．Cis-acting promoter [5×GRE-AdMLP]を組み込んだ腫瘍選択的増殖レトロウイルス・ベクター RRVに、治療遺伝子として非分泌型に改変したヘプシジン3種類のcDNAを組み込み、有効なウイルス・パーティクルを調製する。２．RRV-5×GRE-AdMLP-Met-hepcidin-20、RRV-5×GRE-AdMLP-Met-hepcidin-22およびRRV-5×GRE-AdMLP-Met-hepcidin-25の3種類のウイルス（対象ウイルスとしてRRV-5×GRE-AdMLP-emerald GFP、RRV-5×GRE-AdMLP）を食道癌由来細胞株に感染させ、デキサメタゾン添加後の細胞増殖曲線を求め、細胞増殖抑制効果を示す。３．非分泌型ヘプシジンがどのようなメカニズムで細胞増殖抑制効果、しいては殺細胞効果を示すのか不明である。そこでアポトーシス、ネクローシス、パイロトーシス、フェロト－シス、エントーシス、ネトーシスなどのパスウェイで特徴的なタンパクの変化、特徴（リン酸化など）を捉え、細胞死の分子メカニズムを明らかにする。４．食道癌由来細胞株の皮下移植マウスモデルにおけるRRV由来非分泌型ヘプシジンの抗腫瘍効果をin vivoで示す。腫瘍径の客観的な計測にIVIS Imaging Systemを使用する予定である。そこでシフェラーゼ遺伝子導入細胞クローンの作製を行う。治療実験でレトルウイルスを使用することから、シフェラーゼ遺伝子導入にはプラスミド・ベクターを応用する。pGL4.50[luc2/CMV/Hygro] vectorを改変し、pGL4.50[luc2-IRES-GFP/CMV/Hygro] vectorを作製し、GFP発現の有無を利用してシフェラーゼ遺伝子導入クローンを樹立する。
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