| Project/Area Number |
23K08186
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
下村 治 筑波大学, 医学医療系, 講師 (60808070)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松阪 諭 筑波大学, 医学医療系, 客員研究員 (00372665)
小田 竜也 筑波大学, 医学医療系, 教授 (20282353)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 膵癌 / 循環腫瘍細胞 / 糖鎖 / レクチン / Liquid biopsy |
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| Outline of Research at the Start |
癌の遠隔臓器転移は、循環腫瘍細胞(CTC)によりもたらされる。現在最も有力検出システムであるCellSearchは、上皮マーカー陽性、血液マーカー陰性によりCTCを補足するが、腫瘍細胞が上皮間葉移行(EMT)の際に、上皮マーカーが脱落する為、マーカー陰性となった多くのCTCが検出できてない問題があった。申請者は膵癌細胞表面にはH type 1/3/4型糖鎖が表出し、rBC2LCNというレクチンで認識できる事を発見した。本研究では、レクチンによる新しいCTC回収の手法、捕捉したCTCの遺伝子発現および糖鎖プロファイルを分析し、CTC情報に基づいた膵癌診断技術の研究基盤を作る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は膵癌の転移を引き起こす循環腫瘍細胞CTCを、従来の抗体を用いた手法に加えて細胞の最外層を覆う糖鎖に着目し、糖鎖－レクチン反応を応用した新しいCTC検出法を開発し、回収したCTCの解析を行うものである。本年度は、膵癌細胞株を用いて、実際にCTC回収に用いられるEpCAM抗体磁気ビーズと、膵癌細胞株に特異的に反応するrBC2LCNレクチン磁器ビーズを作成し、In vitroでの回収効率の違いを検証した。まず有効に膵癌細胞株を検出可能なビーズの作成を行った。一定のビースとレクチンの各種濃度を検証し最適な回収効率となる条件を設定した。次にrBC2LCNレクチンへの反応性が異なる（認識糖鎖エピトープの発現が異なる）3種類の細胞株（Capan-1、SUIT-2、白血病細胞株Jurkat）を用意し、作成したレクチンビースでの回収効率を検証した。細胞株ごとの回収率は、認識糖鎖が発現するCapan-1は59.3％、糖鎖が発現しないSUIT-2、Jurkatでは11.3％、2.5％と回収効率に違いがあった。今後更に、EpCAM抗体ビースを作成し、上記の回収効率の違いを検証する予定である。また、臨床検体を用いた解析として、8例の膵癌患者血液から従来のCTC回収用フィルターを用いたCTCの回収を行った。3例で有核細胞が回収され、これらが癌細胞であることを検証するためにKRAS変異を確認し、1例ではKRAS変異が確認された。今後、症例を増やして現状のフィルターでのCTC回収効率を検証し、レクチンでフィルターのコーティングを行い、回収効率が上昇するかを検証する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
目的①rBC2LCNレクチン新規CTCの回収に向けて、レクチン磁器ビーズでの回収が可能であることをIn vitroで確認した。今後更に現行の抗体ビーズとの回収効率を複数の細胞株と実験系を用いて検証する予定である。
②実際の膵癌患者から取得した血液から、従来のフィルターを用いてCTCの回収に成功した。またこれらのKRAS遺伝子変異を解析し、一部では変異を確認し膵癌細胞であることを確認した。更に臨床情報の照合を行っていく。
③CTCの糖鎖遺伝子解析については、解析が可能な細胞が検出できることが確認できたので、今後の予定とする。
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| Strategy for Future Research Activity |
目的①膵癌細胞株を用いた検証として、上記で検証したrBC2LCNレクチン磁器ビーズを用いて、これまで用いられてきたEpCAM抗体ビーズと各種膵癌細胞株の回収効率の違いを検証する。更に実際のヒト血液中に、これらの細胞株を混入させたモデルを作成し、レクチンビーズと抗体ビーズの回収効率を検証し、最適に膵癌細胞株を回収できる手法を検証する予定である。
目的②現行のフィルターを用いてCTCが回収できることを確認し、さらにKRAS遺伝子の変異も同定できた。従来のフィルターにレクチンを固相化し、回収効率に変化が出るかを検証する予定である。回収できたCTCは培養液で増殖できるかも同時に検証する方針とした。
目的③臨床検体から回収したCTCはSingle CTC RNA/Glycan解析（scGRsec）で、クラスター分類し、遺伝子変異から腫瘍細胞を含むクラスターの糖鎖、遺伝子を解析を予定している。これまでの検証で解析可能なCTCが実際の膵癌患者から回収できることが分かったが、まだ回収効率が不十分であり、十分なCTCの集団を回収できない可能性がある。①、②の進行状況で、より効率的な回収が可能となった時点で、患者血液から回収したCTCを含む細胞集団のSingle CTC RNA/Glycan解析を予定する。
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