| Project/Area Number |
23K08191
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
大北 喜基 三重大学, 医学系研究科, 准教授 (20378342)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
志村 匡信 三重大学, 医学部附属病院, 助教 (90734575)
北嶋 貴仁 三重大学, 医学部附属病院, 助教 (30586772)
奥川 喜永 三重大学, 医学部附属病院, 教授 (30555545)
池内 浩基 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (80319863)
問山 裕二 三重大学, 医学系研究科, 教授 (00422824)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | クローン病 / 癌 |
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| Outline of Research at the Start |
近年クローン病（CD）の長期罹患例は増加傾向にあり、それに伴い癌合併例が増加してきている。肛門病変長期罹患例には直腸肛門管癌を念頭に置いた腰椎麻酔下生検および内視鏡が推奨されているものの、その侵襲の大きさから十分に行われていないのが現状である。本研究では、CDの慢性炎症により癌化が誘発される癌部におけるゲノム異常と網羅的解析による発癌過程でのエピゲノム変化を同定し、CD癌化のリスク診断および早期癌診断のバイオマーカーの候補とする。またそれが血清, 尿に反映されることが確認できれば、内視鏡や生検粘膜採取が困難な癌患者を非侵襲的検査法で同定できることが期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年クローン病（CD）の長期罹患例は増加傾向にあり、それに伴い癌合併例も増加傾向にある。肛門病変長期罹患例には、直腸肛門管癌を念頭に置いた腰椎麻酔下内視鏡および生検が推奨されているものの、その侵襲の大きさからスクリーニングが十分に行われていないのが現状である。また、直腸肛門管癌以外の大腸癌・小腸癌に対しても有用とされる、早期発見のための手段は確立されていない。したがって本研究では、CDの癌化のリスク診断および早期癌診断のバイオマーカーを発見することを目的とした。 2000年10月から2022年8月までに三重大学および兵庫医科大学で行われたクローン病関連癌に対する手術症例を対象とした。そのうち最終病理診断で癌合併症例は三重大学9例、兵庫医科大学70例、非癌合併例は三重大学300例、兵庫医科大学1660例経験し、パラフィン包埋した組織を保管している。
三重大学病院で手術を施行したＣＤ患者情報から、非癌合併CDと癌合併CDを選定した。パラフィンブロックからマイクロダイセクション法により非癌合併CD患者の正常粘膜(①)および癌合併CD患者の近傍正常粘膜(②)および癌部(③)から組織を採取した。 これらの組織よりDNA/ＲＮＡを抽出、外注検査に委託し、網羅的DNAメチル化解析ならびにmiRNA解析を行った。①群vs.③群、②群vs.③群をそれぞれ比較検討することで、癌部（③群）で有意に高メチル化している遺伝子および高発現しているmiRNAを同定した。この中で候補となるＤＮＡを設定し、非癌合併CD患者(n=100)の正常粘膜および癌合併CD患者(n=5)の近傍正常粘膜、癌部からDNAを抽出し、バイサルファイト処理後パイロシークエンサーにて候補メチル化DNAのプロモーター領域におけるCpGサイトのメチル化レベルを定量した。これにより癌部で有意に高メチル化を示すDNAを複数特定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
古い検体を含むため、組織の選定およびDNA/ＲＮＡの抽出に時間を要した。また、世界的にパイロシークエンスに関わる試薬の供給が一時不安定となったことにも影響をうけた。
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| Strategy for Future Research Activity |
候補miRNAをqPCRあるいはddPCRにて発現を定量し、再現性を検証する。そのうえで、癌部で有意に高メチル化DNAまたは高発現miRNAであるもの（再現性がある）を、循環血清中の癌合併CD患者診断法の候補マーカーとして、2023-25年で前向きに集めた患者の血清および尿を用いて検証を行う。候補となるCD癌特異的メチル化DNA、miRNAの血清、尿での定量を行うために、非癌合併CD患者(n=100)および癌合併CD患者(n=5)の術前血清、尿からDNA、RNAを抽出する。メチル化DNAの定量に関しては、バイサルファイト処理後digital PCR を用いてqMSP法を行い、候補遺伝子のプロモーター領域におけるCpGサイトのメチル化レベルを定量する。標準化として単位量当たりの血清、尿中の全バイサルファイトDNA量とし、β-actinまたはLine-1にて定量し、補正する。miRNAに関しては、TaqMan real time PCR法で定量を行う。Normalizerとしてcel-miR-39外部標識として混注する。メチル化DNAおよびmiRNAマーカーの癌合併UC患者診断能を検証するためにROC解析を行い、感受性、特異度、正診率そしてcut-off値を作成する。またcombination ROC解析でメチル化DNAおよびmiRNAマーカー両者のパネルを用い癌合併CD患者診断能が上がるかを検証する。
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