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フィーダーフリー下に培養した肺胞上皮細胞による肺の再生

Research Project

Project/Area Number 23K08303
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 55040:Respiratory surgery-related
Research InstitutionTokyo Women's Medical University

Principal Investigator

神崎 正人  東京女子医科大学, 医学部, 教授 (80277136)

Project Period (FY) 2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords肺胞上皮細胞 / 組織工学 / 肺再生医療
Outline of Research at the Start

慢性呼吸不全の唯一の救命手段が肺移植だが、ドナー不足は深刻で、肺再生医療の果たす役割は大きい。本申請では、ガス交換に不可欠な細胞であるAEC再生を異種由来細胞を用いず、フィーダーフリーでAECを培養し、効率的な培養法、分化増殖能を評価し、AECの細胞シートを移植し、AECの特性、肺への生着率、動向からAECの臨床応用の可能性を検討する。

Outline of Annual Research Achievements

肺胞上皮細胞(alveolar epithelial cell;AEC)は、肺で酸素を取り込み、二酸化炭素を排出するガス交換に不可欠、重要な細胞である。I型AEC(AEC1)とII型AEC(AEC2)があり、AEC2は、様々な要因で死滅したAEC1を補填するためにAEC1に分化する。また、重症肺炎、敗血症など様々な疾患が原因で引き起こされる急性肺障害(acute lung injury;ALI)では、過剰なAECの死滅により重度の呼吸不全に陥る。一方、慢性に進行した呼吸不全に対する唯一の救命手段は肺移植となる。ドナー不足は深刻で、肺再生医療の果たす役割は大きく、期待が寄せられている。AECの再生では、マウス由来フィーダー細胞との共培養や三次元培養が確立されている。異種由来の細胞を使用し培養せざるを得ず、ヒトに応用するには安全性の担保としては改善余地がある。今回、細胞シート工学を用いAECの単離、培養に成功し、ラットでフィーダーフリー(FF)で培養し、AEC単一細胞シートを作製してきた。本申請では、FF下に培養したAECの効率的な培養法、分化増殖能を評価し、AECを脱細胞化肺に気管内投与、移植しAECの特性、肺への生着率、動向から、AECの臨床応用の可能性を、生着したAECが分泌する肺サーファクタントの分泌量、AECが分泌する各種の因子により検討する。また、脱細胞化肺の作製およびAECの移植は、ヘパリン (50 U/mL) とニトロプルシドナトリウム (1 μg/mL)を含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で右心室を介して肺を灌流し、肺動脈と気管を介して灌流システムに接続し、肺の脱細胞化バイオリアクターに取り付ける。その後、組織をPBS で洗浄し、気管からAEC(2X105 cells)を灌流し、肺の組織再生能に注目し、組織学的検討を行う。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

共培養や三次元培養が確立されている。異種由来の細胞を使用し培養せざるを得ず、ヒトに応用するには安全性の担保としては改善余地がある。細胞シート工学を用いた再生医療技術により、ラットでフィーダーフリーで培養、AEC単一細胞シートを作製している。本申請では、2023年はフィーダーフリー下に培養したAECの効率的な培養法、分化増殖能を評価した。さらに、AECを脱細胞化肺に経気道的に移植した。単離したAECを、rhoキナーゼ阻害剤を含む低Ca 2+ 培地(LCM)を用い、rLN511E8でコーティングした組織培養皿で培養したところ、安定しフィーダーフリーでAECは培養可能であった。その培養したAECを経気道的に移植したが、AECは脱細胞化肺に偏在性に存在していた。脱細胞化肺に関しては、組織学的に局所的に肺サーファクタントD陽性細胞が残存していたが、灌流条件を変えることでnativeの細胞は排除出来た。現在、脱細胞化肺にフィーダーフリー下に培養したAECを繰り返し移植している最中である。

Strategy for Future Research Activity

フィーダーフリー下に培養した肺胞上皮細胞(alveolar epithelial cell;AEC)の効率的な培養法を検討し、単離したAECを、rhoキナーゼ阻害剤を含む低Ca 2+ 培地(LCM)を用い、rLN511E8でコーティングした組織培養皿で培養したところ、フィーダーフリーでAECは急速に培養可能で分化増殖能を有しており、安定し培養可能であった。移植に適するAECの培養条件は最適化出来つつある。本年度、脱細胞化肺に関しては、現時点では組織学的にHE染色では肺内に細胞が存在し、免疫組織学的に局所で肺サーファクタントD陽性細胞が残存していたことから、灌流方法の再検討が必要であり、肺動脈に加え気管からも灌流を行ない、肺の脱細胞化を図りたいと考えている。手技的に複雑ではあるが、灌流条件を見直し、肺の脱細胞化、nativeの細胞の排除を安定し可能にしていく予定である。脱細胞化肺にフィーダーフリー下に培養したAECを繰り返し移植している最中であるが、培養AECの経気道移植では、AECは脱細胞化肺に偏在性に存在していた。脱細胞化肺内に偏りなく、均一な細胞播種方法を検討する予定である。

Report

(1 results)
  • 2023 Research-status Report

URL: 

Published: 2023-04-13   Modified: 2024-12-25  

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