Search for novel variants and their functional analysis by malignant hyperthermia-associated gene panel test

• Project/Area Number: 23K08332
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55050:Anesthesiology-related
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 向田 圭子 広島大学, 病院(医), 寄附講座教授 (20182066)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村山 尚 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (10230012) ; 三好 寛二 広島大学, 病院(医), 講師 (50645364)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: 悪性高熱症 / 遺伝子パネル検査 / カルシウム / RYR1 / CACNA1S / 骨格筋 / 遺伝子

Outline of Research at the Start

悪性高熱症常（MH）は常染色体顕性遺伝の潜在的な致死的筋疾患で、骨格筋細胞内のカルシウム(Ca2+)調節異常が原因である。主な原因遺伝子は、Ca2+調節に関与する1型リアノジン受容体(RYR1)、電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット(CACNA1S)であるが、今までの報告によるとMH患者の30-60％では原因遺伝子が判明していない。本研究では、MHと関連疾患患者とその血縁者を対象とし、RYR1やCACNA1Sに加え骨格筋のCa2+調節に関与する24種類の遺伝子パネル検査を行う。新しいMHの原因遺伝子variantsを発見し、そのCa2+調節機能解析を行い、病原性を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

実験1．遺伝子パネル検査
MH及びその関連疾患患者とその血縁者88名から抽出したDNAについて、24の遺伝子（RYR1, CACNA1S,CACNB1, Stasc3,JP2, TRPV1, JSRP1, CASQ1, CASQ2, SERCA1, KNAA1, CALM1, CALM2, CALM3, FKBP1B, ASPH, SYPL2,ITPR1, 2, 3, STIM1, ORAI1, MEF2A） のvariantsを次世代シークエンサーで検索をおこなった。
実験２．Variantsの抽出
MAFが0.001未満アミノ酸変異を伴うSNVについてin silico (CADD（20以上）, REVEL(0.5以上), mutation taster, polyphen2, SIFT)で、２つ以上のプログラムで病原性ありと判定されたvariantsを抽出した。RYR1のvariants17症例で検出されたが、3症例のみがEMHGとACMG/AMPによりMHの病因である可能性が大きいと判定できた。残り14はVUS(病的意義が不明)のvariants で、このうち３つが新規であった。CACNA1Sについては、3症例でvariantsが検出された。そのうち２つは新規のvarinatsで、１症例では、病原性ありと確定されている変異R174Wがhomoでみつかった。その他22種の遺伝子のvariantsは29症例で検知された。
実験３.VUS(variants of unknown significant)の機能解析
CACNA1Sに見つかった新規変異p.G321VとHRCのp.H9Lfs*17については、凍結myotube を解凍して、そのRYR1機能について検討した。RYR1刺激薬（Caffeine, 4-CmC ）に対する感受性亢進が確認できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

実験１と２は順調に研究を遂行している
実験3の機能検査が遅れている。
RYR1は大きなタンパクであるため、カルシウム調節機能が不明のRYR1のvariantsの作成で、時間を要している。新しい方法を検討中である。
CACNA1Sの機能検査は、順調に行われている。

Strategy for Future Research Activity

悪性高熱症関連遺伝子のパネル検査を希望された症例では、本年度と同様に実験1と２を行う予定である。
VUSのvariantsの機能検査については、RYR1のvariantsについては、HEK細胞に変異RYR1を導入して、そのカルシウム調節機能を検討する予定である。TRPV1では変異TRPV1がある細胞で、RYR1刺激薬に対する感受性の亢進の有無とカプサイシン刺激による細胞内のカルシウム動態を検討する。
変異CACNA1Sのカルシウム調節機能は、RYR1が発現しているHEK細胞に 変異CACNA1S、CACNB1、STAC3, JP2を導入し、RYR１刺激薬と［K +］刺激によるSR内のカルシウムを測定して検討している。
また、TRPV1とCACNA1Sでは、ノックインマウスのmyotubesを用いて、そのRYR1のカルシウム調節機能を検討する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Effects of Remimazolam on Intracellular Calcium Dynamics in Myotubes Derived from Patients with Malignant Hyperthermia and Functional Analysis of Type 1 Ryanodine Receptor Gene Variants (2023)
  • Author(s): Miyoshi Hirotsugu、Otsuki Sachiko、Mukaida Keiko、Kido Kenshiro、Sumii Ayako、Ikeda Tsuyoshi、Noda Yuko、Yasuda Toshimichi、Narasaki Soshi、Kato Takahiro、Kamiya Satoshi、Horikawa Yousuke T.、Tsutsumi Yasuo M.
  • Journal Title: Genes Volume: 14 Issue: 11 Pages: 2009-2009
  • DOI: 10.3390/genes14112009
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Genetic panel testing of malignant hyperthermia patients in Japan (2024)
  • Author(s): Ayako Sumii, Hirotsugu Miyoshi, Keiko Mukaida, Tsuyoshi Ikeda, Kenshiro Kido, Yuko Noda, Toshimichi Yasuda, Sachiko Otsuki, Rieko Kanzaki, Yasuo Tsutsumi
  • Organizer: 18th World Congress of Anaesthesiologists
• [Presentation] 悪性高熱症原因遺伝子であるジヒドロピリジン受容体遺伝子の変異R174W機能解析 (2023)
  • Author(s): 向田 圭子、大月 幸子、野田 祐子、神崎 理英子、三好 寛二、堤 保夫
  • Organizer: 本麻酔科学会第70回学術集会