CRISPR/Cas9システムを用いた新規TLRシグナル制御因子の同定

• Project/Area Number: 23K08469
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55060:Emergency medicine-related
• Research Institution: Musashino University
• Principal Investigator: 渡邊 幸子 武蔵野大学, 薬学部, 助教 (80770619)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: TLR / 炎症 / CRISPR/Cas9 / NF-κB

Outline of Research at the Start

新型コロナウイルス感染症のパンデミックに見舞われ、感染症疾患やそれに続くサイトカインストーム、敗血症の発症機序の解明と有効な治療法の確立が求められているが、免疫担当細胞による細菌の排除には、同定されていない多くのシグナル伝達因子が関与する。一方で、CRISPR/Cas9の発見によりゲノム編集が容易になり、これが全ゲノムレベルのノックアウトスクリーニングなどに応用されてきている。本研究では、これを応用して、特定のシグナル伝達が遮断された細胞だけが生き残るスクリーニング系を構築し、そのシグナル伝達に関与する未知の伝達因子を同定すると共に、感染症疾患の機序解明と克服を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

敗血症などの感染症疾患の克服は、その社会的貢献度の大きさゆえ、TLRの発見以来、炎症性応答を引き起こすNF-κBの活性化に至るシグナル伝達の解明が精力的に進められてきた。その結果、多くのシグナル伝達因子が同定されたが、申請者らのグループは、MyD88 はIRAK-4 と相互作用するがIRAK-1 とはしない、MyD88 によるNF-κB の活性化はTRAF6 の優性阻害変異体で阻害されるが、IRAK-1 による活性化は阻害されない等、既知のシグナル伝達経路では十分に説明できない現象を見出している。これらの現象は、TLRシグナルの下流に既知の分子以外の新たな因子が存在することを示唆するものと考えられる。そこで本研究では、CRISPR/Cas9システムを応用したノックアウトスクリーニング系を構築し、TLRを介するNF-κBの活性化に関与する新たなシグナル伝達因子の同定を試みた。
このスクリーニング系は、シグナル伝達が遮断された細胞のみが生き残り、生き残った細胞の遺伝子を解析することにより、そのシグナル伝達に関与する遺伝子産物を特定するものである。そこでまず初めに、TLR のシグナル伝達が遮断された場合のみ生き残るレポーター細胞の作製を行った。NF-κBが活性化された場合のみ細胞毒素であるdiphtheria toxin A subunit (DTA) が発現し細胞が死滅するようなプラスミドを作製し、このプラスミドをマクロファージ株化細胞であるRAW264細胞へ導入した。DTAは毒性が強く発現させるだけでも細胞が死滅してしまったが、不安定なDTXA変異体や低毒性のDTXA変異体（W153F, W153A）を発現するものを作製することで目的とするレポーター細胞の作製に成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、①レポーター細胞およびgRNAライブラリーの作製によるノックアウトスクリーニング法の確立、②シグナル伝達因子の同定および病態モデルの解析によるスクリーニング法の有効性の確認、を行う予定である。レポーター細胞の作製には既に成功しており、gRNA ライブラリープラスミドおよびCas9 発現プラスミドの準備も整っている。以上のことから、本研究はおおむね順調に進行していると言える。

Strategy for Future Research Activity

2024年度は、作製したレポーター細胞に、gRNA ライブラリープラスミドおよびCas9 発現プラスミドを導入する。導入されたgRNAが、ある遺伝子を破壊しても、その産物がTLRのシグナル伝達に関与しないのであれば、NF-κBの活性化が起こり、DTAによりその細胞は死滅する。一方で、TLRのシグナル伝達に関与するタンパクの遺伝子が破壊された細胞はDTAが発現することなく生き残る。生存した細胞のゲノムDNA を調製し、gRNA 発現カセット領域をPCR で増幅後、塩基配列を解析することで導入されたgRNA 配列がどの遺伝子に相当するのかを解析する。以上より、TLRを介するNF-κBの活性化に関与する新たな因子の同定を試みる。