膠芽腫におけるEGFR意義不明変異の機能解析

• Project/Area Number: 23K08526
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56010:Neurosurgery-related
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 霧島 茉莉 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (10899967)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷本 昭英 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (10217151) ; 横山 勢也 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (20569941) ; 濱田 大治 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (30771480) ; 赤羽 俊章 鹿児島大学, 鹿児島大学病院, 特例助教 (70754480) ; 比嘉 那優大 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (90792200)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 膠芽腫 / EGFR / 意義不明変異 / ゲノム編集

Outline of Research at the Start

我々は神経膠腫診断用カスタム遺伝子パネルで膠芽腫におけるEGFRの意義不明変異⊿2-14 EGFRを検出した。⊿2-14 EGFRの構造解析およびゲノム編集を用いた培養細胞への導入によって、生物学的な機能解析をおこない、その臨床病理学的性格を明らかにする。この研究により、膠芽腫における⊿2-14 EGFRがどのようなタンパク質を発現しているのか、発現している場合にそのタンパク質はどのような分子生物学的な特性で活性化機能を有しているのかを明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、標的遺伝子であるEpidermal Growth Factor Receptor 1（EGFR）遺伝子の細胞外ドメイン欠損であるエクソン2-14欠損 EGFR(⊿2-14 EGFR)をゲノム編集で作製する方法を検討した。⊿2-14 EGFRを作製するため、まず最初にEGFR遺伝子のイントロン1および14を標的としたガイドRNAの作製および切断効率の確認を行い、切断効率の高いガイドRNAを選別した。次に、選別したイントロン1および14に対するガイドRNAとCas9複合体それぞれをエレクトロポレーション法でヒト膠芽腫細胞へ同時に導入したところ、想定した遺伝子欠損（⊿2-14）が誘導されることをDNAおよびmRNAのサンガーシーケンスにより確認した。さらに、ゲノム編集された細胞から標的遺伝子変異を有する細胞をクローン化するために、抗生物質（puromycin）耐性遺伝子を搭載したアデノ随伴ウイルスを作製した。標的遺伝子のゲノム編集を行うと同時にアデノ随伴ウイルスを感染させることで⊿2-14 EGFRを有する細胞をpuromycinでクローニングすることが可能であった。これらの方法を膠芽腫細胞株数種類に適用したところ、いずれの細胞株においても⊿2-14 EGFRを有する細胞がクローン化され、この方法は膠芽腫細胞株において細胞株に依存せず普遍的な方法であることが示された。加えて、EGFR遺伝子イントロン14を標的とするガイドRNAからイントロン8を標的とするガイドRNAに変更することで、EGFR遺伝子の主な遺伝子変異（欠損）であるEGFR vIIIを有する細胞もクローニングすることが可能であったため、本研究ではEGFR遺伝子変異間の比較も可能となった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト膠芽腫細胞株のEGFR遺伝子に対して、ゲノム編集による標的変異を作製することに成功した。この方法を複数の細胞株に使用して、異なる細胞株でクローン化を行っている。来年度はクローン化した標的変異を有する細胞株を用いて機能解析を行う予定であり、おおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

ゲノム編集で作製したクローンについて分子生物学的解析を行い、想定した遺伝子変異を有することを確認する。確認できたクローンから順次機能解析を行う。