内在性プロモーター下融合遺伝子導入による粘液型脂肪肉腫モデルの開発

• Project/Area Number: 23K08592
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 竹山 昌伸 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (50851820)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 真吾 横浜市立大学, 附属病院, 講師 (20622583) ; 加藤 生真 横浜市立大学, 医学部, 助教 (80644939)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2025: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 軟部腫瘍 / 粘液型脂肪肉腫 / がん動物モデル

Outline of Research at the Start

本研究では、FUS-DDIT3融合遺伝子を特徴とする粘液型脂肪肉腫に着目し、オルガノイド培養技術とCRISPR CAS9によるゲノム編集技術を用いて、免疫能と薬物代謝能が正常なマウスを宿主とするがんモデルを構築する。融合遺伝子の導入では、外来遺伝子は導入せず、マウスの内在性プロモーター下に転座を誘導する。更に、追加の遺伝子変異の導入により、ヒト粘液型脂肪肉腫において予後不良な組織学的因子とされる円形細胞成分を含めて模倣可能なモデルの確立を目指す。研究期間を通して、ヒト粘液型脂肪肉腫患者を模倣でき、かつ薬物療法の開発に適した動物モデルを開発する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、FUS-DDIT3融合遺伝子を特徴とする粘液型脂肪肉腫に着目し、オルガノイド培養技術とCRISPR CAS9によるゲノム編集技術を用いて、免疫能と薬物代謝能が正常なマウスを宿主とするがんモデルを構築する。融合遺伝子の導入では、外来遺伝子は導入せず、マウスの内在性プロモーター下に転座を誘導する。令和5年度は、内在性プロモーター下にFUS-DDIT3を誘導する手法を確立するため、主に最適なガイドRNAの条件検討を行った。ガイドRNAの候補を、複数設計し、ガイドRNAとCAS9タンパク質をDNAベクターを用いて、リポフェクションにより細胞に導入した。導入細胞は、当初は計画通りオルガノイドを用いていたが、導入効率が悪かったため、マウス線維芽細胞の、3T3L1細胞に変更した。今年度内に、内在性ゲノムで目的の融合遺伝子が導入出来たことをPCRで確認した。また、ウエスタンブロッティングにより、タンパク質レベルでも、目的の融合遺伝子由来のタンパク質の発現を確認した。現在、限界希釈法により、シングルセルクローニングを試みている。現状まだ完全に単一クローンと呼べる株は得られていない。計画書に記載した、b) 成熟マウスにおけるPrrx1発現組織のスクリーニング、c) 軟部組織オルガノイドの樹立　に関しては、現状では優先度が低いので、いったん延期とする。次年度は、現状得られている株で、計画通りの方針とする。年度内にさらに進むようであれば戻ってこれらの解析も追加する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度内に、実際に内在性のゲノムを編集して融合遺伝子を導入することが出来たため。背景細胞は計画とは異なるが、まず方法論の確立を目指した。結果、目的の細胞株を得ることが出来た。おおむね順調である。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、計画ではオルガノイドに移行する予定であるが、オルガノイドは増殖能が低く、遺伝子組み換えを要する本計画では、使用が困難と予想された。まずは現状の細胞株で可能な解析を進めて行く。