Scx発現細胞を標的としたACL再建術後移植腱の早期再靭帯化についての研究

Research Project

Project/Area Number	23K08614
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 56020:Orthopedics-related
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	舛田哲朗熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (20794530)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	徳永琢也熊本大学, 病院, 特任助教 (60759520) 宮本健史熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (70383768)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2025: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	前十字靭帯再靭帯化 / 前十字靭帯 / Scx陽性細胞 / 再靭帯化
Outline of Research at the Start	膝前十字靭帯（ACL）再建術の臨床成績は向上しているが, 移植腱の力学的強度の回復に長期間を要するなど課題が残っている。近年発生過程において, 前十字靱帯は Scleraxis（Scx）とSRY-box containing gene 9共陽性細胞から構築されることが報告され，Scx陽性細胞はTGF-bの制御を受け間葉系幹細胞より分化するとされている。本研究では，ＡＣＬ再建術後の移植腱におけるTGF-bの腱由来幹細胞およびScx発現細胞への作用と移植腱の力学的強度回復促進効果を明らかにすることを目的とし，腱前駆細胞を標的とした新たな移植腱再靭帯化促進治療法の確立につながるものと考えられる。
Outline of Annual Research Achievements	細胞系譜追跡の手法を用いた解析によって、マウスの前十字靭帯（ACL）発生過程中にScleraxis（Scx）とSRY-box containing gene 9を共発現する細胞がみられることが明らかとなっている。我々はScxGFP ラットを使用したラットACL再建モデルにおいて，術後移植腱内にScx発現細胞認め，ACL切離モデルでは遺残組織内にScx発現細胞が経時的に増加することを確認した。本研究の目的は，前十字靭帯再建術においてScx発現細胞への分化が報告されているCD90陽性細胞である腱由来幹細胞の関与を解析・確認することである。当該年度においては、ラットのACLを切離し、切離後２日，１週，２週，４週に膝組織を採取した。ACL遺残組織内のCD90とScxの発現をRT-PCRおよび組織学的に評価した。CD-90の発現はRT-PCRでは切離後増加し，切離後１週に最大値となりその後低下がみられた。組織学的評価でも同様の結果であった。Scxの発現はRT-PCRでは切離前と比較し切離後増加し，切離後４週に最大値となった。組織学的評価では切離後２～4週でScx発現細胞数が最も多く、その後低下がみられた。ScxGFP遺伝子改変ラットを用いた遺残組織を温存したACL再建モデルにおいて, 術後4週に組織学的評価をおこなったところ，再建靭帯内にScx発現細胞が認められた。以上の結果より，遺残組織を温存したACL再建術後の移植腱再靭帯化の過程において，Scx発現細胞よりも早期にCD90陽性細胞の存在が確認された。本研究を継続することで移植腱再靭帯化の過程の解明につながると考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ScxGFP遺伝子改変ラットの繁殖が遅れており，予定の標本数が達成できていないため，当初の予定よりやや遅れていると判断した。しかし，標本数以外の問題はなく，現在ラットの繁殖も安定してきていることから，次年度の解析は予定通り進めることができると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	前年度と同様のラットACL再建モデルを用いて，移植腱再靭帯化過程におけるCD90陽性細胞の分化能および移植腱の力学的強度を確認する。ACL切離後遺残組織を採取し，CD90陽性細胞をFlow CytometryにてFluorescence assisted cell sortingを行う。単離した細胞を培養し，培養時にTGF-b1を投与し，Scx，Collagen type 1, Tenomodulinの発現をRT-PCR，免疫染色で確認する予定である。また，同方法で単離したCD90陽性細胞にTGF-b1を投与し培養を行った後，ラットACL再建モデル時に関節内に移植する。術後４，６，8週に膝組織を採取し，組織学的評価と張力測定器用いて引っ張り破断試験を行う予定である。