| Project/Area Number |
23K08680
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56020:Orthopedics-related
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
木下 晃 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 准教授 (60372778)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大山 要 長崎大学, 病院(医学系), 教授 (50437860)
谷村 進 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (90343342)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | Myhre症候群 / TGFシグナル / SMAD3 / IDR / 液相分離 / Myhre syndrome / Smad3 / ヒストンメチル化酵素 / Mhyre症候群 / ヒストンメチル化 / 骨系統疾患 |
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| Outline of Research at the Start |
低身長が特徴のMyhre症候群患者に、TGFシグナル系で働く転写因子SMAD3のIDR領域に変異を同定した。IDR領域は立体構造を取らないが、タンパク質相互作用と転写調節に重要な機能を持つ。またモデルマウスの骨芽細胞では、転写を活性化させるヒストンH3の4番目のリジン残基のトリメチル化が著しく減少していた。「SMAD3がIDR領域を介してヒストン修飾酵素と相互作用し、クロマチン構造と遺伝子発現を制御する」との仮説のもと、SMAD3とヒストン修飾酵素が決定する骨形成に必須な遺伝子とその発現調節領域を決定する。ヒストン修飾を標的にした治療法の開発、骨粗鬆症の予防・治療法への展開を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
低身長と短い四肢が特徴の稀な遺伝病Myhre syndrome (MS)はTGFスーパーファミリーシグナル系のシグナル伝達因子SMAD4のミスセンス変異によるSMAD4タンパク質の安定化とTGFシグナルの減弱がその発症機序とされている。
しかし研究代表者は本邦のMS患者で、TGFシグナル系転写因子SMAD3に新規ミスセンス変異を同定した。同定された変異はDNA結合(MH1)ドメインとタンパク質間相互作用(MH2)ドメインに挟まれた立体構造をとらず機能も持たないとされているintrinsically disordered region(IDR)に存在する。しかし近年、IDRを介してタンパク質が相互作用し、クロマチン構造を変えながら転写制御を行うことが明らかになってきた。
研究代表者がゲノム編集技術で作製したMSモデルマウスは患者の表現系を再現した。このマウスから単離した骨芽細胞・軟骨細胞では転写の活発なプロモーターの目印であるヒストンH3の４番目のリジンのトリメチル(H3K4me3)化が著しく減少していた。SMAD3は転写因子であり、直接H3K4me3化することはできない。そこで「SMAD3がIDRを介してヒストンメチル化酵素と相互作用し、クロマチン構造と遺伝子発現を制御する」との仮説のもと、相互作用するヒストンメチル化酵素を同定することを本研究の第一目標とした。IDRを介したタンパク質間相互作用は非常に弱いため、免疫沈降物の質量分析によるタンパク質の同定は失敗した。そこでSMAD3の極近傍(半径10 nm以内)に存在するタンパク質を網羅的にビオチン化する近接依存性標識法を採用し、ヒストンメチル化酵素の一つを同定した。モデルマウスの表現系解析、クロマチン免疫沈降法によるSmad3の結合領域の同定、RNA-seqによる発現解析も続けている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度行った研究は以下である。①近接依存性標識法によるヒストンメチル化酵素の同定：IDRを介したタンパク質相互作用は非常に弱いため免疫沈降法による同定は昨年度失敗している。近接依存性標識法は、その名の通り半径10 nm以内の極近傍に存在するタンパク質を網羅的にビオチン化する新規技術である。SMAD3とビオチンライゲースAirIDの融合遺伝子をHCT116細胞に発現させ、TGF-beta1とビオチンを培地に添加することでSMAD3の近傍に存在するタンパク質をビオチン化する。ビオチン化タンパク質はストレプトアビジンビーズで回収し、イムノブロッティングで検出可能である。この手技によりヒストンメチル化酵素XがSMAD3と極近傍にあることがわかった。また患者で同定された変異SMAD3ではこの相互作用が消失していた。これがMSの発症機序であると考えられる。② マウスの表現系解析:(i)体重測定によりMSモデルマウスでは誕生時には野生型と差がないが、生後1週間後から体重増加が遅くなり有意な差が観察された。(ii)新たに長崎大学に導入されたマイクロCTを用いて、野生型と変異型マウスの骨格解析を行い、比較を行っている。(iii) Smad3抗体とヒストンメチル化酵素X抗体を用いて、クロマチン免疫沈降 (ChIP) をおこなった。次世代型シーケンサーによる配列決定を行ったが、明確なSmad3とXの結合領域のピークが得られなかった。おそらく抗体が原因と考えられる。④ 骨芽細胞のRNA-seqを行い、野生型と有意な差があるパスウェイを同定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの失敗を踏まえて今年度は以下のように研究を進めていく。
① 6XHisタグと蛍光タンパク質タグをつけたヒストンメチル化酵素XとSMAD3 (野生型と変異型)タンパク質の精製を行う。XのcDNAは全長5 kb以上と大きくGC-richなためクローニングが困難である。このためPCRで増幅可能なIDR領域のみをクローニングした。XのIDRタンパク質の精製を行っているが、分解が激しく精製が上手くいっていない。共同研究者や経験者の意見を参考に手技を改善し、精製を行い顕微鏡下での相分離実験を行う。 ② 免疫沈降とChIPが上手くいかなかった原因の一つが抗体の性能である。別の抗体を新たに購入するか、FLAGタグをつけたSMAD3(野生型と変異型)発現ベクターを培養細胞にトランスフェクションする予定である。以前の論文(Kinoshita, Development, 2021)でも市販抗体で上手くいかなかった免疫沈降やChIPが、タグ付き遺伝子発現ベクターをトランスフェクションすることで解決できた実績がある。 ③ これまで軟骨はマウス胸骨・肋骨を酵素処理して、単離してきたが、新たに成長板や関節から軟骨細胞を単離するプロトコールを確立した。この軟骨細胞を材料に、RNA-seqやChIP-seqによりMSの特徴である四肢の短縮の発症機序を解明する。 ④ マウスの表現系解析を続ける。⑤ マウス大腿骨 (特に成長板周辺）組織を用いてシングルセルRNA-seq解析を行う。⑥ 次年度中に論文の作成・投稿を行う。
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