局所進行頭頸部癌の低酸素腫瘍微小環境に及ぼす嫌気性菌関与の解明

• Project/Area Number: 23K08942
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56050:Otorhinolaryngology-related
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 京 雪楓 和歌山県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (70316123)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 玉川 俊次 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (40543781) ; 酒谷 英樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (30817317) ; 奥田 勝也 和歌山県立医科大学, 医学部, 学内助教 (40888327)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: 頭頸部癌 / 微小環境 / 嫌気性菌 / Fusobacterium / 腫瘍微小環境

Outline of Research at the Start

頭頸部癌の浸潤・転移・再発に、細胞増殖と血管新生の不均衡に起因する腫瘍低酸素環境の関与が明らかとなり、腫瘍内低酸素環境制御は有望な新規抗腫瘍治療として注目されている。さらに腫瘍内細菌叢により誘導された上皮間葉移行の発癌や癌進展への関与の報告から、腫瘍内低酸素環境と腫瘍内細菌叢との関連性が考えられる。口腔内細菌叢に曝露される頭頸部癌では口腔内細菌叢との関連を示す研究はあるが、腫瘍内細菌叢と微小環境との関係については未解明である。本研究では頭頸部癌における腫瘍内細菌叢を明らかにし、細菌叢とりわけ嫌気性菌が腫瘍内低酸素微小環境に与える影響を解明する。

Outline of Annual Research Achievements

頭頸部癌の浸潤・転移・再発に、細胞増殖と血管新生の不均衡に起因する腫瘍低酸素環境の関与が明らかとなり、腫瘍内低酸素環境制御は有望な新規抗腫瘍治療として注目されている。さらに腫瘍内細菌叢により誘導された上皮間葉移行の発癌や癌進展への関与の報告から、本研究では腫瘍内低酸素環境と腫瘍内細菌叢との関連に着目した。申請者は、乳癌細胞株を用い中枢神経系で高発現した受容体チロシンキナーゼに属するEphA4の抑制がもたらす腫瘍微小環境下インスリン様増殖因子の減少が腫瘍増殖と転移を抑制することを明らかにした。口腔内細菌叢に曝露される頭頸部癌では口腔内細菌叢との関連を示す研究はあるが、腫瘍内細菌叢と微小環境との関係については未解明である。本研究は、頭頸部癌の低酸素腫瘍微小環境の形成における嫌気性菌F.nucleatumの関与を明らかにすることを目的とする。
頭頸部癌の細胞株をF.nucleusとの共培養が低酸素因子を中心とした腫瘍微少環境に与える変化について実験を行っている。頭頸部癌細胞株の培養条件の設定はおおむね良好であり、F.nucleatumの嫌気培養を曝気法で行っている。曝気法にて培養液にはF.nucleatumが培養され、吸光度の変化も認めているが平板培地でのF.nucleutumの確認とコンタミネーションの除外が未だできていない。下咽頭癌細胞株とF.nucleatumの培地を合わせた共培養の条件は予備実験を行い、時間や濃度設定は終えているため、F.nucleatumの選択培地での培養とコンタミネーションの除外を行った後に、qPCR法でHIF-1α、NF-kB、STAT-3、IL-17、TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1の発現を評価する予定である。
和歌山県立医科大学の倫理委員会にて研究内容の承認を受け、頭頸部癌患者からの検体採取を開始している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

和歌山県立医科大学の倫理委員会に研究概要を提出し、2024年4月25日に承認を受けた。細菌叢解析については外部委託での解析の価格を交渉中である。
組織からの組織抽出についてはmirVana miRNA Isolation Kit(Ambion)、cDNAの合成ではHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Ambion)を購入し準備している。TaqMan probeはGAPDH、HIF-1α、NF-kB、STAT-3、IL-17、TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1を購入し保存中である。正常組織と腫瘍部の細菌叢解析を用いた発現比較を行い、頭頸部癌細胞株を用いた実験へとすすめる予定である。
頭頚部癌細胞株を用いた実験系ではFusobacterium nucleatumの培養に関しては、曝気法を用いて細菌培養は可能となったが、嫌気チャンバーの器材が整わないため細胞株とFusobacterium nucleatummの共培養は困難である。そのため、Fusobacterium nucleautumの代謝産物を抽出することで、細胞株を用いてLPSが頭頸部癌細胞株の遺伝子発現やmicroRNAに与える発現について検討する予定にしている。

Strategy for Future Research Activity

下咽頭癌細胞株とF.nuclaetum株との共培養の条件は予備実験を行い、時間や濃度設定は終えているため、F.nucleatumの選択培地での培養とコンタミネーションの除外を行った後に、qPCR法でTRPV-1、HIF-1α、NF-kB、STAT-3、IL-17、TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1の発現を評価する予定である。