低濃度抗癌剤による癌細胞の動態変化とエクソソームの変化について

• Project/Area Number: 23K08946
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56050:Otorhinolaryngology-related
• Research Institution: Kanazawa Medical University
• Principal Investigator: 石坂 智 金沢医科大学, 医学部, 助教 (70862530)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小川 武則 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (50375060) ; 島崎 猛夫 金沢医科大学, 総合医学研究所, 准教授 (50377420) ; 北村 守正 金沢医科大学, 医学部, 教授 (60543262)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 低濃度抗癌剤 / エクソソーム / 抗癌剤治療耐性 / がん幹細胞 / スフェロイド

Outline of Research at the Start

頭頸部癌は、抗PD-1抗体であるnivolmabとpembrolizumabの２剤が承認されCPS（Combined Positive Score) が治療の適否や効果予測に関わるマーカーとである。しかし腫瘍が分泌するエクソソーム表面にはPD-L１が発現しているが、治療効果予測因子として考慮されていない。我々の研究では、腫瘍から分泌されるエクソソーム量は癌細胞の個性により異なり、エクソソームに発現する分子組成も薬剤により変化した。抗癌剤によるエクソソーム表面のPD-L1の変化を解析することで、抗PD-1抗体療法の治療効果予測の改善や、PD-L1発現エクソソームを誘導しない治療法の開発を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

本研究のテーマは、抗がん剤治療耐性メカニズムの解明である。一つの仮説として、生体ではがん細胞は立体構造となっており、抗がん剤治療によっても中心部の細胞まで到達する抗がん剤は低濃度であると考えられる。我々の仮説は、特に中心部などの低濃度でしか暴露されなかった癌細胞が生き残り、その作用により耐性を獲得するという仮説であり、まずは低濃度の抗がん剤による細胞の反応を確認することからスタートした。まずは、一般的に知られている2次元平面培養法を用いて、5-FUなどの頭頚部領域で使用される抗がん剤を用いて、MTTアッセイを用いて経時的な生存細胞数を評価した。結果、3種類の頭頚部癌細胞（SAS,HSC3,HSC-4）について、IC20、IC50、IC80の濃度を決定した。次に、細胞を立体状に培養する３D培養法を用いて、前述の3種の癌細胞のスフェロイド形成性に関する評価を行った。スフェロイドとは、球状に細胞が集合した状態を示し、近年注目を浴びている。このスフェロイドは、立体構造を有する3Dがん細胞塊を意味しており、スフェロイド状になった癌細胞は、平面培養における細胞と比較して生体内腫瘍により近い性質を有しがんの医学生物学研究や抗がん剤開発の上で有用なモデルとなるのではないかと考えられている。これらのスフェロイドを中心とした病理解析やDNA解析や遺伝子解析を行い、低濃度抗癌剤によるエクソソームの動態変化を解析していく。最終的には、治療予測マーカーとしてのエクソソームの意義とスフェロイドによる抗がん剤治療耐性メカニズムついて明らかにしたい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度の研究において、スフェロイドを用いた当研究室オリジナルの病理標本作成キットが完成した。各種癌細胞（SAS・HSC-3・HSC-4）と抗癌剤（CDDP・5-FU）を組み合わせたスフェロイドのパラフィンブロックを作製する。これらを使用し、HE及び各種抗体で免疫染色を行い、様々なタンパク質を特異的に検出することができるようになったため。これらの結果を受けて、DNA解析や遺伝子解析に進んでいくことができる。

Strategy for Future Research Activity

今年度の研究で、病理標本作成キットが完成し、免疫染色を行っている。その結果を受けて、同じ抗体のmRNAをQPCRで定量化を行い、評価する。その後Western Blottingを行い、タンパク質の検出や発現量の評価、分子量の推定を行う予定である。その後は、遺伝子解析も行っていく予定である。その結果を受けて海外発表および論文の作成を予定している。