| Project/Area Number |
23K09034
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56060:Ophthalmology-related
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| Research Institution | Chubu University |
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Principal Investigator |
西沢 祐治 中部大学, 生命健康科学部, 教授 (80252229)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 千聖 中部大学, 臨床検査技術教育・実習センター, 助教 (50794210)
榊原 明 中部大学, 生命健康科学部, 准教授 (20510217)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | 網膜色素変性症 / 視細胞 / アポトーシス / オートファジー / グリチルリチン / トランスジェニックラット / 免疫電子顕微鏡法 / ラパマイシン / 小胞体ストレス |
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| Outline of Research at the Start |
P347L型変異ロドプシン導入トランスジェニックラット（P347Lラット）は、網膜色素変性症（RP）の研究において、非常に有用なモデル動物であることが分かっています。このラットでは、生後9日目から視細胞の急激なアポトーシスが進行し、14日目でほぼ全ての視細胞が消失するという早期の病態進行が見られます。先行研究では、このP347Lラットに対してラパマイシンを微量注入することで、一過性に視細胞のアポトーシスを抑制できることが明らかになりました。また、網膜組織培養でのアポトーシス抑制作用機序の解明や、ラット個体レベルでの疑似点眼実験による非侵襲薬物投与の効果を検証することが研究の目的です。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2024年度の研究では、遺伝性の疾患である網膜色素変性症（RP)を持つモデルラット（Tgラット）を用いて、特にグリチルリチンによるオートファジー促進効果について、免疫電子顕微鏡法を使ってターゲットタンパク質の共局在を分析した。この研究は、網膜視細胞が急速に損傷を受けるこの疾患の治療薬の可能性を探るものである。
具体的には、生後8日目にTgラットにグリチルリチンを投与し、10日目と12日目に網膜を採取して、免疫電子顕微鏡法の固定・脱水・樹脂包埋を行い、超薄切片を作製して、ロドプシンとオートファジーマーカーであるSTX17またはLC3に対する抗体を反応させた。次に金コロイド結合二次抗体を反応させ、重金属電子染色を行った。試料を透過型電子顕微鏡で観察した結果、コントロールと比較して、グリチルリチン投与ラット視細胞の細胞質において、ロドプシンとLC3との共局在の増加が顕著に観察された。この結果は、グリチルリチンがオートファジーを促進し、オートファゴソームが変異ロドプシンを確実に取り込んで消化を行っていることを示しており、生化学的な手法では捉えることができなかった変異ロドプシンの分解によるアポトーシス抑制の経路の存在を強く示唆している。一方、オートファゴソームへのロドプシンの取り込みをさらに確実に証明するために行ったSTX17に対する免疫細胞化学では、ロドプシンとSTX17との共局在およびLC3とSTX17との共局在については、増加傾向は観察されたがばらつきが大きく、今後の追加実験を計画している。
以上の研究成果は、網膜色素変性症の細胞死の進行を遅延させる新たな治療戦略の開発に寄与すると考える。グリチルリチンがオートファジーを促進し、その結果として細胞保護効果を発揮する可能性を強く示しており、将来的にはこれを応用した治療薬の開発が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
理由
2024年度の研究では、遺伝性の疾患である網膜色素変性症（RP）を持つP347Lラットを用いて、特にグリチルリチンのオートファジー促進効果について免疫電子顕微鏡法を用いて積極的に分析を進めた。これまでの研究で、グリチルリチンがオートファジーを促進することによってアポトーシスを抑制し、網膜視細胞の細胞死を遅延させることが可能であることを明らかにした。
具体的には、個体レベルでの実験を通じて、グリチルリチンの投与がオートファジーマーカータンパク質の発現増加を促す効果を確認した。さらに、免疫電子顕微鏡観察によって、変異ロドプシンとオートファジーマーカーであるLC3との共局在を確認し、これがグリチルリチンによるオートファジー活性化によって変異ロドプシンの確実な分解の明確な証拠となっている。この免疫細胞化学によるロドプシンとオートファジーマーカータンパク質との共局在の詳細な解析に多くの時間を費やしたために、網膜組織培養による解析系を構築してin vitroでの薬剤効果と網膜視細胞への保護効果の調査の開始に至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度の研究では、遺伝性疾患である網膜色素変性症（RP）を持つP347Lラット網膜視細胞に対する免疫細胞化学を用いた研究を通じて、グリチルリチンのオートファジー促進効果を確認してきた。今後の研究推進方策としては、従来の研究計画にしたがって以下のステップを踏むことを計画している。
まず、グリチルリチンの効果をさらに詳細に解析するために、複数の時間点で網膜組織を採取し、オートファジー関連タンパク質の定量的な変化を検証する。
これにより、薬剤投与の最適なタイミングと量を特定し、効果の持続性や時間依存性のパターンを明らかにする。
次に、新たに網膜組織培養による解析系を構築し、in vitroでの薬剤効果と網膜視細胞への保護効果を詳細に調査する。この培養システムを利用することで、薬剤の細胞への直接的な影響をより迅速かつ効率的に評価し、メカニズムの解明を深める。
さらに、グリチルリチンの治療効果を高めるために、他のアポトーシス抑制薬やオートファジー促進薬との併用効果を評価する実験を実施する。異なる薬剤との組み合わせにより、相乗効果を生み出す可能性がある。
最後に、研究成果を臨床応用に繋げるために、他のRPモデル動物を用いた前臨床試験を計画し、人間における治療法としての安全性と有効性を段階的に検証していく。
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