ミエロイド系細胞のオートファジーに着目した慢性炎症性眼疾患の治療法の検討

• Project/Area Number: 23K09039
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56060:Ophthalmology-related
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 古藤田 優実 山梨大学, 大学院総合研究部, 臨床助教 (00535619)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柏木 賢治 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (30194723) ; 古藤田 眞和 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (30530133)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: オートファジー / ミエロイド細胞 / 眼疾患 / 炎症

Outline of Research at the Start

細胞内自食機構であるオートファジーの、炎症調節作用への関与が示唆されている。緑内障や加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症のメカニズムに炎症の関連が示唆される中で、上記の学術的背景を考慮すると、オートファジーは眼疾患の発症・進行の病態生理においても重要な役割を担っている可能性が示唆される。しかしこれまでに網膜・視神経病変における炎症系細胞のオートファジーの役割は検証されておらず、発症・進行メカニズムへの関与は不明である。本研究では、各種眼疾患モデルを用いて炎症系細胞のオートファジーの役割を検証し、その調整に伴った原疾患治療の可能性を探る。

Outline of Annual Research Achievements

Atg5f/f LysMCreマウス(ミエロイド細胞のみでオートファジーが欠損しているマウス)およびAtg5f/fマウス（オートファジー機能が正常なコントロールマウス）を交雑して遺伝子型判定を行い、実験に使用するAtg5f/f LysMCreマウスおよび同胞コントロールマウス（Atg5f/fマウス）を用意した。まずAtg5f/f LysMCreマウスの眼球における表現型を調べるため、網膜厚および眼圧をコントロールマウスと比較した。網膜厚は光干渉断層計による平均網膜厚（網膜内層厚および網膜全層厚）と、摘出眼球のHE（ヘマトキシリン・エオジン）染色標本による網膜中心動脈・視神経を含む断面の網膜全層面積の測定を行った。光干渉断層計による評価においては、若年マウスの網膜厚は、全層厚・網膜内層厚ともにコントロールマウスと有意差を認めなかったが、老齢マウスにおいてはAtg5f/f LysMCreマウスの方が網膜内層厚が厚い結果であった。HE染色標本での網膜全層面積は有意差がなかった。
麻酔鎮静下で測定した眼圧はAtg5f/f LysMCreマウスとコントロールマウスとで有意差は認めなかったことから、Atg5f/f LysMCreマウスにおいては眼圧以外の要素で視神経保護機構が働いている可能性が示唆された。視神経挫滅モデルマウスを作成し、Atg5f/f LysMCreマウスとcontrolマウスにおいて網膜神経節細胞複合体の減少率が異なるかどうかの検証を試みたが、安定した結果が得られなかったため、他のモデルや評価法でのアプローチを検討中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

実験に使用するAtg5f/f LysMCreマウスおよびAtg5f/fマウスの作製および遺伝子型判定は順調に行えている。疾患モデルを用いた検証に先立ち、Atg5f/f LysMCreマウスの表現型を評価することとし、光干渉断層撮影法および組織染色により網膜膜厚（網膜内層厚および網膜全層厚）および眼圧を評価した。視神経挫滅モデルマウスを用いた実験では安定した結果が得られなかった。炎症性眼疾患におけるマクロファージのオートファジーの機能の検証のため、角膜疾患を含め他のモデルや評価法を用いたアプローチを検討中である。

Strategy for Future Research Activity

炎症性角膜障害モデル（リポポリサッカライド投与・アルカリ障害・角膜上皮剥離モデルなど）を検証モデルに加え、炎症や治癒過程におけるミエロイド細胞のオートファジーの機能を評価する。オートファジー機能の確認にはウエスタンブロット法やELISA法を用いてオートファジー関連タンパクの評価を中心に行う。各種組織染色（ヘマトキシリン・エオジン染色やフルオロセイン染色など）および免疫染色法（マクロファージや好中球を標的とした免疫染色）を用いた組織学的評価により炎症の程度や治癒過程の評価、および炎症性細胞の浸潤や集積の評価を行う。さらに角膜への機械的刺激への反応閾値や疼痛などの神経学的機能も継時評価する。オートファジー促進薬や阻害薬を用いてこれらの炎症や神経機能、組織治癒過程への作用を評価する。