| Project/Area Number |
23K09039
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56060:Ophthalmology-related
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
古藤田 優実 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (00535619)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柏木 賢治 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (30194723)
古藤田 眞和 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (30530133)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | オートファジー / ミエロイド細胞 / 眼疾患 / 炎症 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞内自食機構であるオートファジーの、炎症調節作用への関与が示唆されている。緑内障や加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症のメカニズムに炎症の関連が示唆される中で、上記の学術的背景を考慮すると、オートファジーは眼疾患の発症・進行の病態生理においても重要な役割を担っている可能性が示唆される。しかしこれまでに網膜・視神経病変における炎症系細胞のオートファジーの役割は検証されておらず、発症・進行メカニズムへの関与は不明である。本研究では、各種眼疾患モデルを用いて炎症系細胞のオートファジーの役割を検証し、その調整に伴った原疾患治療の可能性を探る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ATG5f/f LysM-Cre(+)（ATG5cKO）マウスとATG5f/f LysM-Cre(-)(コントロール)マウスの角膜に、NaOHを浸したろ紙を静置し、角膜アルカリ障害モデルを作成した。
角膜混濁スコア（score:0-4）を評価したところ、day8の時点で、ATG5f/f LysM-Cre(+)（ATG5cKO）マウスでは、ATG5f/f LysM-Cre(-)(コントロール)マウスに比較して、角膜混濁有意に角膜混濁スコアが低かった（2.7±0.64 vs. 3.3±0.49, Day 8, 各10匹, P＜0.05）。8日目に角膜を採取し、ミエロイド系細胞（好中球・マクロファージ）の角膜浸潤と好中球細胞外トラップ（neutrophil extracellular traps: NETs）を免疫蛍光染色により評価したところ、好中球およびマクロファージの浸潤数に両グループ間で有意差はなく（それぞれP=0.7145、P＝0.5586)マクロファージの浸潤はどちらのグループにおいても軽微であった。
アルカリ角膜障害において好中球細胞外トラップNETs（neutrophil extracellular traps）の関与が報告されていることと、加齢性のATG5欠損でNETsの障害が報告されていることから、ミエロイド細胞のオートファジー障害が、NETsを抑制することで角膜混濁が軽減した可能性を考え、day8の角膜においてNETsの評価を免疫蛍光染色にて行った。NETsの発現は少なく、両群間で有意差は認めない結果（P＝0.6944）であり、より早期の段階でのミエロイド細胞の浸潤または機能（NETs発現）などが角膜混濁の差異をもたらした可能性があると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
LPS角膜混濁モデルを作成を試みたが、混濁の程度が一定せず、モデル確立が困難であったため、アルカリ角膜障害モデルを作成。アルカリの濃度やろ紙の直径、点眼麻酔の有無などを変更しながら適切なモデルを確立した。アルカリ角膜モデルにおいて、角膜混濁におけるミエロイド細胞のオートファジーの関与が示唆され、マクロファージおよび好中球の定量評価をおこなったが、角膜の免疫染色でうまくマクロファージが染色されなかった。
そのため、角膜標本の作製および染色方法を試行錯誤し、時間を有した。両群ともに好中球浸潤は著明であり、過去の文献から、好中球細胞外トラップ(NETs)に差が認められる可能性が考えられたため、NETsの定量評価を試みたが、両群間とも、day8の時点においてはNETsがほとんど認められなかった。技術的な問題かどうかを見極めるために、繰り返しの評価、検証が必要となりこちらも時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
アルカリ角膜障害眼においてday1,day3など早期のタイムポイントで、ミエロイド細胞の細胞浸潤やNETsの評価を行うことを検討している。
アルカリ角膜障害モデルのアポトーシス評価にTUNEL染色を用い、角膜混濁への関与を確認する。
リアルタイムPCRおよびELISA/Western blotにより各種サイトカインやケモカイン（TNFα 、IL1β、IL4、IL6、IL8、IL10、IL18、MCP1、MMP2、MMP9、CCL2、CCL5）の発現・産生を評価する。
リポソーム化させたオートファジー阻害剤や促進剤を投与することで、角膜混濁の変化を確認する。
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