ヒト乳歯歯髄幹細胞培養上清によるメラニン生成の抑制効果とその作用機序解明

• Project/Area Number: 23K09087
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56070:Plastic and reconstructive surgery-related
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 井上 槙也 東京医科大学, 医学部, 客員研究員 (00972431)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 善本 隆之 東京医科大学, 医学部, 教授 (80202406)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ヒト乳歯歯髄幹細胞 / 培養上清 / メラニン生成抑制 / メラノサイト / 間葉系幹細胞 / 歯髄幹細胞培養上清

Outline of Research at the Start

今日、間葉系幹細胞（MSC）を用いた細胞移入療法の臨床研究が盛んに行われているが、MSCの細胞培養上清（CM）の投与が、細胞フリー療法として免疫拒絶を考慮する必要がなく、安全性も高いため注目されている。本研究では、まず、私達が最近作製した不死化ヒト脱落乳歯由来の歯髄幹細胞（SHED）の培養上清（SHED-CM）が、in vitroの細胞培養系でメラニン生成を抑制する作用機序を分子レベルで明らかにし、次に、in vivoで紫外線照射による皮膚の色素沈亢進モデルマウスを用いて、SHED-CMの治療効果とその作用機序について明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

2022年度は、不死化したヒト脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清（SHED-CM）のマウスメラノーマのメラニン生成抑制効果について検討を行った。
①SHED-CMのメラニン生成抑制効果：マウスメラノーマとしてB16F1とB16F10を用いた。まず、SHED-CMによるメラニン生成の抑制効果を調べるため、B16F1細胞をSHED-CMおよびコントロール培地、ポジコンとしてアルブチン共存下で72時間培養し、細胞を回収し遠心すると、SHED-CMの濃度を上げていくと沈渣の黒味が減ってきた。そこで、細胞を溶解後メラニン量を分光光度計で定量すると、アルブチンよりより強くSHED-CM濃度依存的に低下した。さらに、チロシナーゼ活性をL-DOPAを基質として測定すると、同様に、その活性がSHED-CMにより強く阻害された。同様な結果は、B16F10でも見られた。
②SHED-CMによるメラニン生成抑制効果の作用機序：そこで、次に、作用機序を明らかにするため、SHED-CMで刺激24時間後にRNAを抽出し、RT-qPCRによるmRNA発現解析を行うと、チロシナーゼmRNAが強く発現低下し、そのシグナル伝達系の上流に位置するTyrosinase-related protein-1/2（TRP1/2）や、小眼球症関連転写因子（MITF）、b-Catenin、GSK-3bの発現も低下していた。さらに刺激72時間後に細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロット解析によっても、これらの分子の発現が低下、または、低下傾向にあった。つまり、SHED-CMは、チロシナーゼ発現を誘導するシグナルのかなり上流部分に効いている可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

不死化したヒト脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清（SHED-CM）によるメラニン生成抑制効果が明らかになってきているので、ほぼ計画の予定通り進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

2024年度：SHED-CMがメラニン生成を抑制する作用機序の検討
SHED-CMによるメラニン生成の抑制効果の作用機序を明らかにするため、SHED-CMの抗体アレイを用いた網羅解析や個別のELISAにより、個々のサイトカインや増殖因子の濃度が高そうな分子や、以前にメラニン生成抑制活性を示すことが報告されている分子の組換え蛋白質をB16F1細胞に加え、メラニン生成への影響を調べる。次に、メラニン生成を抑制する活性が強かった分子について、その中和抗体とコントロール抗体、または、そのsiRNAを遺伝子導入し産生をノックダウンしたSHED-CMとコントロールsiRNAを同様に処理したSHED-CMなどを比較検討し、メラニン生成抑制に重要な分子を明らかにする。
2025年度：紫外線照射で誘導する色素沈着モデルマウスでのSHED-CMによる色素沈着抑制効果の検討
紫外線照射したマウスで誘導する色素沈着モデルマウスを用いて、in vivoでの色素沈着形成へのSHED-CMの抑制効果について検討する。C57BL/6マウス背部の毛をバリカンと除毛剤で除去後、紫外線照射を３回照射し、毎日SHED-CMおよびコントロール培地を染み込ませたガーゼを背中の張り、経時的に皮膚が黒色化する様子を写真で撮影し、色素沈着の程度を画像解析ソフトを用いて定量する。３週間後に皮膚組織のメラニンをFontana-Masson染色や、MITFやチロシナーゼ、TRP1/2に対する抗体を用いた免疫蛍光染色と、皮膚組織よりトータルRNAを調製し、それらの分子のRT-qPCR解析を行う。昨年までの検討で得られた重要な分子の抗体を用いて除去したSHED-CMを調製し、上述のマウスに投与し、in vivoでの関与を検討する。

Research Products

• [Journal Article] A Promising Needle-Free Pyro-Drive Jet Injector for Augmentation of Immunity by Intradermal Injection as a Physical Adjuvant (2023)
  • Author(s): Jukito Sonoda,Izuru Mizoguchi,Shinya Inoue,Aruma Watanabe,Ami Sekine,Miu Yamagishi,Satomi Miyakawa,Natsuki Yamaguchi,Eri Horio,Yasuhiro Katahira,Hideaki Hasegawa,Takashi Hasegawa,Kunihiko Yamashita and Takayuki Yoshimoto
  • Journal Title: Int J Mol Sci. Volume: 24 Issue: 10 Pages: 9094-9094
  • DOI: 10.3390/ijms24109094
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Potent antitumor effects of the conditioned medium of bone marrow-derived mesenchymal stem cells via IGFBP-4. (2023)
  • Author(s): Furusaka Y, Inoue S, Mizoguchi I, Hasegawa H, Katahira Y, Watanabe A, Sakamoto E, Sekine A, Miyakawa S, Umezu T, Owaki T, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: in press Issue: 6 Pages: 2499-2514
  • DOI: 10.1111/cas.15789
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Chemical- and Drug-Induced Allergic, Inflammatory, and Autoimmune Diseases via Haptenation. (2023)
  • Author(s): Sakamoto E, Katahira Y, Watanabe A, Furusaka Y, Sekine A, Yamagishi M, Sonoda J, Miyakawa S, Inoue S, Hasegawa H, Yo K, Yamaji F, Toyoda T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Biology (Basel) Volume: 12(1) Issue: 1 Pages: 123-123
  • DOI: 10.3390/biology12010123
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protective effects of conditioned media of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous teeth on pressure ulcer formation (2023)
  • Author(s): Katahira Yasuhiro、Murakami Fumihiro、Inoue Shinya、Miyakawa Satomi、Sakamoto Eri、Furusaka Yuma、Watanabe Aruma、Sekine Ami、Kuroda Masahiko、Hasegawa Hideaki、Mizoguchi Izuru、Yoshimoto Takayuki
  • Journal Title: Frontiers in Immunology Volume: 13 Pages: 1010700-1010700
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.1010700
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Induction of potent antitumor immunity by intradermal <scp>DNA</scp> injection using a novel needle‐free pyro‐drive jet injector (2022)
  • Author(s): Inoue Shinya、Mizoguchi Izuru、Sonoda Jukito、Sakamoto Eri、Katahira Yasuhiro、Hasegawa Hideaki、Watanabe Aruma、Furusaka Yuma、Xu Mingli、Yoneto Toshihiko、Sakaguchi Naoki、Terai Kazuhiro、Yamashita Kunihiko、Yoshimoto Takayuki
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 114 Issue: 1 Pages: 34-47
  • DOI: 10.1111/cas.15542
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ヒト乳歯歯髄幹細胞のセクレトームによるストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルマウスの末 梢神経障害の抑制 (2024)
  • Author(s): 堀尾江里、山岸美宇、片平泰弘、長谷川英哲、井上槙也、渡邉有麻、関根碧水、園田寿希心、溝口 出、善本隆之
  • Organizer: 第23回日本再生医療学会総会
• [Presentation] ヒト乳歯歯髄幹細胞由来馴化培地のX線照射による白髪化に対する保護効果 (2024)
  • Author(s): 片平泰弘、長谷川英哲、井上槙也、渡邉有麻、関根碧水、山岸 宇、山口夏輝、徐 明利、溝口 出、善本隆之
  • Organizer: 第23回日本再生医療学会総会
• [Presentation] Conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous teeth inhibit melanogenesis by suppressing Wnt signaling via Wnt5a. (2023)
  • Author(s): Inoue S, Sekine A, Katahira Y, Yamagishi M, Sonoda J, Watanabe A, Miyakawa S, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: JSICR/MMCB 2023 Joint Symposium