| Project/Area Number |
23K09211
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
飯田 俊二 北海道大学, 大学病院, 講師 (30281827)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
赤坂 司 北海道大学, 歯学研究院, 准教授 (00360917)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞 / 骨芽細胞 / 分化誘導 / 石灰化 / マイクロナノパターン |
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| Outline of Research at the Start |
独自デザインを持ったマイクロ・ナノパターンを設計し、歯髄幹細胞から歯牙や歯周組織再生を目指す。歯牙・歯周組織再生は解決すべき課題であるが、問題の一つは幹細胞から目的の組織を作製する効率的な制御技術がないことである。ここでは歯髄幹細胞に注目し、「象牙質やセメント質の生体疑似微細パターンをデザインすれば、歯髄幹細胞から誘導して正常な立体構造を持った歯周組織が再生できるのでは？」と着想した。
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| Outline of Annual Research Achievements |
概要として、１）パターン化研究材料の製造で使用する基本パターンを、基本形状としてピラー、グルーブ、ホールを100nm～50μmスケールでパターン化した。
２）基礎分化誘導に関しては、ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞（SHED）、Saos-2細胞（ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞）、MG63細胞（ヒト骨肉腫細胞）を用いて骨芽細胞への分化誘導を行った。増殖後に細胞を計数して、細胞染色用として、またRNA抽出用として各細胞を播種し。播種後培養した。その後分化誘導培地にて１週間ごとに細胞を回収しながら４週間培養した。アリザリンレッド染色による石灰化の検出は１週間ごとに回収した細胞を固定した。固定後にアリザリンレッド染色液を入れて観察した。定量PCR法による骨芽細胞分化マーカーの検出は、回収した細胞のRNAを抽出し抽出したRNAをテンプレートにしてcDNAを合成した。
結果は分化誘導培地にて培養した細胞は、細胞の分布がまだらであった。分化誘導培地で培養した各細胞をアリザリンレッド染色したところ、SHEDでは１週間で強く染色された。また２週間培養したところ強く染色され3、4週間でも同様であり、今回の培養条件ではSHEDは2週間程度で石灰化がみられた。Saos-2細胞では、SHEDより石灰化が早く１週間で強く染色された。MG63細胞はどの時点でもほとんど染色されておらず、今回の培養条件では石灰化が進まない結果となった。分化誘導前（0d）および分化誘導2週間後（14d）の各細胞からRNAを抽出し、抽出液のRNA濃度を測定した。得られたRNA量はいずれの細胞も分化誘導されるとRNA収量が減少する傾向があり、特にSHEDでは得られるRNA量が少なかった。細胞検出には今後蛍光標識プローブを用いるものと、SYBR Greenをもちいるもので検出感度を比較して感度を上げるようにする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
おおよそ計画通り実験について、進行しているが、様々なブロックパターンに対応するための各種細胞の条件設定にやや時間を要しており、条件設定が決まれば次のステージに進めると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究の軸として、１）パターン化研究材料の製造 ２）基礎分化誘導評価 ３）立体構造評価 ４）動物実験 の４段階の項目を考えている。そのうち１）のパターン科研究材料の製造はある程度めどが立ったのと、現在行っている細胞培養条件が確立されたら、歯髄幹細胞の単純パターン上での分化誘導を評価する。ヒト乳歯と永久歯歯髄幹細胞を用い、パターン上で培養し、蛍光・電子顕微鏡観察、各種特徴遺伝子のPCR法、FACS等その他で分化を評価する。歯髄幹細胞の未分化状態での培養だけではなく、分化では脂肪系・骨系（象牙質、セメント質）・線維系、神経系への誘導を注視し、特に象牙質やセメント質形成に重要な細胞が産生するコラーゲン線維の配向性・太さ制御やアパタイト形態に注目して詳細な検討する。比較ではコラーゲン三次元足場を用いる。これら歯髄幹細胞の検討により、パターンによる細胞機能・組織化向上の法則化や複雑化パターンの基礎データ取得を目指す
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