上顎洞底挙上術の臨床応用に向けた脱分化脂肪細胞由来エクソソーム徐放化技術の開発

• Project/Area Number: 23K09366
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 57060:Surgical dentistry-related
• Research Institution: Osaka Dental University
• Principal Investigator: 窪 寛仁 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (70388362)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 橋本 典也 大阪歯科大学, 歯学部, 教授 (20228430) ; 城 潤一郎 大阪歯科大学, 歯学部, 准教授 (60511243)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2025: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: エクソソーム / 上顎洞底挙上術

Outline of Research at the Start

自家骨を用いた上顎洞底挙上術が行われ、現在も自家骨が移植材料のゴールデンスタンダードとなっている。しかし、自家骨を用いる際に生じる採取部の外科的侵襲、採取量の制限、移植骨の吸収などの問題がある。これらの問題点を解決するために細胞を用いた骨再生に関する基礎的および臨床的研究が行われてきた。その担い手として挙げられるのが、エクソソームである。エクソソームは細胞に由来する顆粒状物質であり、細胞間シグナル伝達の役割を担っている。本研究では、純度が高く分化能の高い脱分化脂肪細胞由来骨芽細胞より分泌されるエクソソームとゼラチンハイドロゲル徐放化システムを用いた新しい移植材料を開発する。

Outline of Annual Research Achievements

成長因子は単独では生体内寿命が短く不安定であるため、これを再生の場で持続的に放出させる必要がある。 Tabataら(J Controlled Release 1994;31: 189-199)は、細胞増殖因子を高濃度で持続的に作用させる方法として、ゼラチンハイドロゲルを用いた細胞増殖因子の徐放化システムを開発した。このシステムを用いることで細胞増殖因子の生体内での活性低下を抑制することが可能となり、またゼラチンの含水率を変えることで徐放効率の調節を可能にした。申請者らはエクソソームについてもこの徐放化システムが有効ではないかと考えた。そこで、本申請課題においては、「ゼラチンハイドロゲルシステムで徐放化したDFATs由来エクソソームで上顎洞底挙上術は可能か」と言う本質的な問いに対する検証を本研究の目的とする。
頬脂肪体より脂肪組織を採取し、天井培養法によってDFATを樹立した。DFATをコンフルエントに達したのちに、骨芽細胞分化誘導化培地に変更し、培養した培養上清（DFAT-OI-Ev）と通常培養で得た培養上清（DFAT-ctrl-Ev）それぞれをサイズクロマトグラフィー法にてEvの抽出を行った。透過型電子顕微鏡（以下TEM）による画像解析、ナノサイト解析、ナノフローサイトメトリーを行った。骨芽細胞誘導培地と各Ev（DFAT-OI-Ev、DFAT-ctrl-Ev）をDFATに添加し、7日目、14日目にALP活性の測定を行い、遺伝子発現をRT-PCRにて定量した。DFAT-EvはナノフローサイトメトリーにてCD9、CD63陽性であった。TEMにて脂質二重膜をもつ直径約100 nmの粒子を確認した。DFAT-OI-Ev添加骨分化培地群はALP活性、runx2、Type I collagenの発現はEvの添加をしていない群と比較して有意に高い値となった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

頬脂肪体より脂肪組織を採取し、天井培養法によってDFATを樹立した。DFATをコンフルエントに達したのちに、骨芽細胞分化誘導化培地に変更し、培養した培養上清（DFAT-OI-Ev）と通常培養で得た培養上清（DFAT-ctrl-Ev）それぞれをサイズクロマトグラフィー法にてEvの抽出を行い、それぞれのキャラクタリゼーションを行ったため

Strategy for Future Research Activity

それぞれのEvよりmiRNAを抽出しsmall RNA-seq解析を行う。