CD44高発現口腔扁平上皮癌細胞におけるBeclin-1を介した癌幹細胞形質の制御機構の解明

• Project/Area Number: 23K09370
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 57060:Surgical dentistry-related
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 重石 英生 広島大学, 医系科学研究科(歯), 准教授 (90397943)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 太田 耕司 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (20335681) ; 小野 重弘 広島大学, 病院(歯), 講師 (70379882)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 癌幹細胞 / CD44 / 口腔癌 / Beclin-1

Outline of Research at the Start

Beclin-1（BECN1）は、オートファジー誘導に関連するタンパク質で、癌の発生や増殖などに関係しているが，口腔癌幹細胞におけるBECN1の機能は不明である。本研究においては、これまでの成果をさらに発展させ、BECN1により制御される口腔扁平上皮癌幹細胞に特有な癌幹細胞形質の制御機構を明らかにする。さらに口腔癌幹細胞において制御される個々の遺伝子産物の発現と機能を検討し、ヒト口腔扁平上皮癌における高度悪性化機構の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

Beclin-1（BECN1）は、オートファジー誘導に関連するタンパク質で、癌の発生や増殖などに関係しているが、口腔癌幹細胞におけるBECN1の機能は十分に検討されていない。本研究においては、これまでの成果をさらに発展させ、BECN1により制御される、口腔扁平上皮癌幹細胞に特有な癌幹細胞形質の制御機構を明らかにすること目的とする。
1.　 口腔癌細胞株OM-1細胞とCD44高発現OM-1細胞をラミニン332でコーティングしたシリコンゲル（弾性率；2.0kPaの）上で培養した。CD44高発現OM-1細胞を用いて、オートファジー関連遺伝子であるBECN1の発現を検討した結果、CD44高発現OM-1細胞のBECN1 mRNA発現は、OM-1細胞と比較して有意に増加していた。また、CD44高発現OM-1細胞のLC3 mRNA発現は、OM-1細胞と比較して有意に増加していた。。さらに、CD44高発現OM-1細胞における、幹細胞マーカーの発現を検討した結果、CD44高発現OM-1細胞のBMI1, OCT4, KLF4 mRNA発現は、OM-1細胞と比較して有意に増加していた。
2．CD44高発現OM-1細胞におけるBECN1と癌幹細胞形質との関係を検討するため、BECN1 siRNA ノックダウン後の、幹細胞マーカーの発現を検討した。その結果、CD44高発現OM-1細胞におけるBMI1, OCT4, KLF4 mRNA発現は、BECN1 siRNA ノックダウン後に有意に減少した。さらに、スフィアコロニーの形成能について検討した結果、CD44高発現OM-1細胞におけるスフィアコロニーの形成数は、BECN1 siRNA ノックダウン後に有意に減少した。
3. BECN1とアポトーシス抵抗性との関係を明らかにするため、BECN1 siRNA ノックダウンCD44高発現OM-1細胞を用いて、5-FU存在下での細胞外LDH量を測定した。その結果、BECN1ノックダウン細胞では、コントロール細胞と比較して、細胞外LDH量は有意に増加した。
以上の結果から、BECN1は、CD44高発現OM-1細胞における幹細胞性の維持および抗癌剤抵抗性に関与している可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CD44高発現OM-1細胞において、BECN1は幹細胞性の維持に重要な役割を担っている可能性が明らかとなった。また、癌幹細胞周囲の微小環境（細胞外基質、足場の弾性率）による癌幹細胞形質の維持機構の存在が示唆された。さらに、BECN1は、CD44高発現OM-1細胞における抗癌剤抵抗性に重要な役割を担っている可能性が示唆された。これまでの研究結果から、CD44高発現細胞が、口腔扁平上皮癌における高度悪性化機構に関与している可能性が示唆され、本研究課題はおおむね順調に進んでいると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

1. CD44高発現OM-1細胞を用いて、オートファジーインヒビターの存在下で、抗がん剤により誘導されるアポトーシスを解析する。これにより、オートファジーと抗癌剤抵抗性との関係を明らかにする。
2．miR-506-3pはBECN1の発現を調整する重要なmicroRNAである。CD44高発現OM-1細胞にmiR-506-3p inhibitorまたはmiR-506-3p mimicsを遺伝子導入し、コロニー形成能、幹細胞マーカー遺伝子の発現、アポトーシス抵抗性、オートファジー活性について検討する。

3.口腔癌細胞株にBECN1過剰発現ベクターを遺伝子導入し、スフィアコロニー形成能、アポトーシス抵抗性、オートファジー活性などを検討する。これにより、BECN1の口腔扁平上皮癌における高度悪性化への関与を明らかにする。